光引发聚合改性明胶用于牙组织工程的方法观察论文

论文范文 时间:2019-11-08 我要投稿
【www.unjs.com - 论文范文】

  组织工程化牙髓牙本质复合体常用的支架材料有羟磷灰石(hydroxyapatite,HA)-磷酸三钙(tricalcium phosphate,TcP)、纳米碳化硅(silicon carbide,sic)增强HA复合材料,明胶、胶原、甲壳素等,三维支架为新生组织提供了生长空间,支持细胞生长,增殖并模拟胞外基质的许多功能。明胶被广泛用作生物医用材料,但其凝胶性不耐久,35℃以上即溶化为溶胶态。如果利用明胶侧链基团反应活性高的性质,将丙烯酸类单体接枝到明胶分子上,就可在正常体温条件下长时间保持明胶的凝胶形态。甲基丙烯酸(methylacrylic acid,MA)改性后的明胶在紫外光和光引发剂共同作用下可生成水凝胶,是软骨组织工程研究中使用的一种支架材料,这种可注射光引发聚合水凝胶材料能够自我塑形,用于填充形状和尺寸各异的组织缺损,造成的创伤小,能使得细胞均匀分布在支架材料内部呈三维立体生长,提供仿生的环境,水凝胶含有大量的水分可支持营养物质和细胞代谢产物的交换。因此本研究以人牙髓细胞(human dental pulp cell,hDPC)为对象,研究光引发聚合甲基丙烯酸改性明胶(gelatin methacrylate,GM)水凝胶是否有作为牙髓再生支架材料的潜能。

  1.材料和方法

  1.1材料

  A型明胶(acid-processed gelatin,G)、94%MA、艳固佳2959型光引发剂(Sigma公司,美国),透析袋(Biosharp公司,美国),a型改良伊格尔培养基(modi-fied eagle's medium of alpha type,u-MEM)、改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco'smodified eagle medium,DMEM)(Hyclon公司,美国),胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)(Hyclon公司,美国);磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)(武汉博士德生物工程有限公司),青霉素-链霉素、I型胶原酶、分散酶、0.25%胰酶(Gibco公司,美国);细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)-8(Kumamoto公司,日本);台盼蓝染液(Sigma公司,美国);平底六孔培养板(Nunc公司,美国)。紫外光交联仪(Hoefer公司,美国);冷冻干燥机(北京博仪康公司);ACE200型200MHz高分辨率超导核磁共振(nuclear magneticresonance,NMR)仪(Bruker公司;德国);扫描电子显微镜(scan-ning electron microscope,SEM)(FEI公司,荷兰);旋转流变仪(Haake公司,德国);倒置相差显微镜(Nikon公司,日本);倒置荧光显微镜及照相系(Olympus公司,日本)。

  1.2方法

  1.2.1合成GM将1g G与10 mL PBS溶液混合,在50℃恒温条件下搅拌20 min以上直至明胶完全溶解,再缓缓加入浓度为94%的MA 1 mL,继续在50℃条件下搅拌,反应持续1 h。随后加入10℃的PBS溶液40 mL,充分混合后置于截留相对分子量为(8-14)×103的透析袋中,在40℃条件下用双蒸水透析1周。透析后的溶液用液氮迅速冷冻后,真空冷冻干燥机冻干处理1周,密封保存于-80℃。

  1.2.2分析GM 1)NMR:取0.5 mg GM、G和MA分别溶于D.0,用高分辨率超导NMR检测三者的结构构象,并对比。2)SEM:分别扫描GM的断面和表面,观察其表面形貌。

  1.2.3制备GM水凝胶用60℃的PBS将GM配成质量分数10%的溶液,0.02 um滤器过滤除菌后,转入超净台内操作。取10 mL该溶液,加入50 mg光引发剂充分混匀,配成GM水凝胶准备液。取1 mL GM水凝胶准备液置于六孔板中,放入紫外交联仪,选择光强8 mW·cm-2、365 nm条件下辐照10 min,GM准备液聚合成GMTk凝胶。

  1.2.4 GM水凝胶的力学性能质量分数10%的GM准备液制备成的直径约50 nm,厚度大于1 mm的GM水凝胶设为实验组,质量分数10%G溶液制备成的G凝胶设为对照组,规格同上。选用37℃恒温-频率扫描模式,用流变仪检测2组的黏弹性,间接反映2种材料的力学性能。

  1.2.5培养hDPC取临床18-25岁患者因阻生需要拔除的健康完整的牙齿(四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准且患者知情同意),参照Gronthos采用的取材方法,在无菌条件下劈开牙齿,取出牙髓组织,切除根尖1/3部分,PBS反复冲洗;将牙髓组织剪碎成小于1 mmx1mmx1mm的组织块,含3 g·L-1的I型胶原酶和4 g·L-1的分散酶溶液于37℃水浴锅中消化组织块30 min,离心5 min、弃上清,含20%FBS的u-MEM培养液调整细胞密度,混匀后接种于25 cm22培养瓶中,37℃、5%CO2温箱中培养2 d,半量换液,然后每3 d更换培养基1次。待细胞生长融合达80%时,0.25 g·L-1胰酶消化传代,按1×105个·mL-1细胞数接种传代后培养。

  1.2.6 GM水凝胶的细胞毒性和生物相容性1)直接法:取第三代hDPC,用无菌的GM水凝胶准备液制备成细胞浓度为1×106个,mL-I的细胞悬液,在紫外光聚合反应中形成细胞GM水凝胶,随后转移至已添加培养基的六孔板中,常规培养3 d之后,在光镜下观察细胞生长状况。2)间接法:以GM水凝胶:DMEM培养基=0.2 g:1 mL的比例,密封后置于细胞培养孵箱中3 d,提取GM水凝胶浸提液作为A组;用同样的方法处理DMEM培养基作为B组。A、B两组液体分别加入10%FBS,1%双抗,培养hDPSC。3 d后小心弃去孔板中的培养基,PBS清洗后加入数滴0.4%台盼蓝溶液,室温下染色,5 min后吸出染液,PBs清洗残留染液,光镜下观察蓝染细胞,评估GM水凝胶的细胞毒性。CCK-8法测A组和B组培养7 d的细胞增殖曲线,从而评估GM水凝胶对细胞增殖的影响。

  2.结果

  2.1 GM的制备与表征

  MA改性明胶在光引发剂引发下,经紫外光辐照后形成水凝胶。GM冻干后肉眼可见呈疏松多孔结构,易溶于水,SEM扫描断面可见大小均一数量颇多的孔隙结构(图1左),孔径大约10 um,而表面的图像也能看到致密多孔(图1右),孔径15-25 um,这种结构在形成水凝胶仍然会保持,孔隙会增大,有利于细胞的黏附长入,并且可保留大量水份支持细胞的营养代谢。从NMR图像(图2)上来看,可以看到GM结合了MA的甲基,在(5~6)×10-6处形成了代表特征性的MA酰胺结构的峰,而改性前后明胶特异性的谱图基本保持一致,说明改性对明胶的整体分子结构没有重大影响。

  2.2GM水凝胶的力学性能

  在使用流变仪测量过程中,GM水凝胶的形态没有出现明显变化,而G凝胶在37℃恒温测量台上已经变成溶胶状态。测量结果如图3所示,在0.01-100Hz的频率扫描模式下,GM水凝胶储存模量接近于明胶的10000倍,说明GM水凝胶具有弹性,在一定的范围内,随着频率的增加,GM水凝胶的弹性模量和损耗模量几乎保持不变。而G凝胶则明显不同,弹性模量与损耗模量则随着频率的增加而大幅度增加。说明在经过甲基丙烯酸改性之后,减少了明胶分子链之间的滑动,弹性模量和损耗模量受频率的影响大大降低(图3)。

  2.3GM水凝胶的细胞毒性和生物相容性

  用CCK-8测量7 d的增殖曲线(图4),可见GM浸提液培养的细胞增殖速度略低于DMEM培养基,但基本保持逐渐递增的趋势,说明GM水凝胶对hDPC无明显毒性抑制作用,在一定程度上能维持细胞的生长。

  将牙髓细胞-GM准备液悬液经紫外光引发聚合形成细胞GM水凝胶,培养2 d后观察到细胞能在凝胶中维持基本形态。用GM水凝胶浸提液培养细胞,与普通DMEM培养基对照,2 d后用台盼蓝染色,死细胞被染成蓝色,镜下可见少有细胞蓝染,其余细胞形态良好(图5)。

  3.讨论

  牙组织工程是时下研究热点之一,组织工程牙髓再生能够规避传统根管治疗的弊端,恢复牙髓的支持营养功能,避免牙髓丧失造成的牙体变脆崩裂。以往研究中用HA-TCP支架材料复合牙髓细胞再生牙髓牙本质复合体,在裸鼠皮下得到了很好的效果,但原位再生研究要考虑牙齿根管系统形态多样,错综复杂,应该选用一种可以任意塑形,和天然牙髓组织相近的支架材料,使种子细胞呈三维生长,从而构建再生牙髓。

  明胶的分子构象为杂乱的多肽链,侧链上有大量的羟基、羧基和氨基。本研究利用MA与侧链上的氨基结合形成MA酰胺结构,可以使明胶的一些理化性能得到优化,比如增加了多孔性,且在紫外光引发下能聚合成水凝胶。GM形成凝胶态后,表面依然保留多孔结构,孔径约为100um,牙髓细胞接种后能较好地黏附、长入、形成三维生长的模型。采用紫外光引发聚合形成的GM水凝胶在37℃条件下性能稳定。用流变仪测量力学性能,GM水凝胶能在0~100Hz的频率递增条件下保持高水平的稳定,机械性能大大优于普通明胶。说明GM水凝胶可以在体内实验中保持稳定,抵抗一定的机械作用力。另一方面,通过浸提液培养法及CCK-8法检测,间接证明了本材料具有良好的生物相容性。光镜下观察牙髓细胞能在水凝胶中均匀分布,活性良好。牙髓组织需要丰富的血供,而曾有研究使用GM水凝胶构建微血管,证明了它的可行性。最重要的一点,这种水凝胶的力学性能以及多孔性可以随着反应条件的改变而调节,凝胶时间也可以通过光引发剂的浓度而变化,这为后期的体内实验以及具体应用上提供了一定灵活的空间。综上所述,这种MA改性明胶水凝胶有望成为一种良好的牙髓再生组织工程支架材料。