光引发聚合改性明胶用于牙组织工程的方法观察论文
组织工程化牙髓牙本质复合体常用的支架材料有羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）-磷酸三钙（tricalcium phosphate，TcP）、纳米碳化硅（silicon carbide，sic）增强HA复合材料，明胶、胶原、甲壳素等，三维支架为新生组织提供了生长空间，支持细胞生长，增殖并模拟胞外基质的许多功能。明胶被广泛用作生物医用材料，但其凝胶性不耐久，35℃以上即溶化为溶胶态。如果利用明胶侧链基团反应活性高的性质，将丙烯酸类单体接枝到明胶分子上，就可在正常体温条件下长时间保持明胶的凝胶形态。甲基丙烯酸（methylacrylic acid，MA）改性后的明胶在紫外光和光引发剂共同作用下可生成水凝胶，是软骨组织工程研究中使用的一种支架材料，这种可注射光引发聚合水凝胶材料能够自我塑形，用于填充形状和尺寸各异的组织缺损，造成的创伤小，能使得细胞均匀分布在支架材料内部呈三维立体生长，提供仿生的环境，水凝胶含有大量的水分可支持营养物质和细胞代谢产物的交换。因此本研究以人牙髓细胞（human dental pulp cell，hDPC）为对象，研究光引发聚合甲基丙烯酸改性明胶（gelatin methacrylate，GM）水凝胶是否有作为牙髓再生支架材料的潜能。
1.材料和方法
1.1材料
A型明胶（acid-processed gelatin，G）、94%MA、艳固佳2959型光引发剂（Sigma公司，美国），透析袋（Biosharp公司，美国），a型改良伊格尔培养基（modi-fied eagle's medium of alpha type，u-MEM）、改良杜氏伊格尔培养基（dulbecco'smodified eagle medium，DMEM）（Hyclon公司，美国），胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）（Hyclon公司，美国）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）（武汉博士德生物工程有限公司），青霉素-链霉素、I型胶原酶、分散酶、0.25%胰酶（Gibco公司，美国）；细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）-8（Kumamoto公司，日本）；台盼蓝染液（Sigma公司，美国）；平底六孔培养板（Nunc公司，美国）。紫外光交联仪（Hoefer公司，美国）；冷冻干燥机（北京博仪康公司）；ACE200型200MHz高分辨率超导核磁共振（nuclear magneticresonance，NMR）仪（Bruker公司；德国）；扫描电子显微镜（scan-ning electron microscope，SEM）（FEI公司，荷兰）；旋转流变仪（Haake公司，德国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；倒置荧光显微镜及照相系（Olympus公司，日本）。
1.2方法
1.2.1合成GM将1g G与10 mL PBS溶液混合，在50℃恒温条件下搅拌20 min以上直至明胶完全溶解，再缓缓加入浓度为94%的MA 1 mL，继续在50℃条件下搅拌，反应持续1 h。随后加入10℃的PBS溶液40 mL，充分混合后置于截留相对分子量为（8-14）×103的透析袋中，在40℃条件下用双蒸水透析1周。透析后的溶液用液氮迅速冷冻后，真空冷冻干燥机冻干处理1周，密封保存于-80℃。
1.2.2分析GM 1）NMR：取0.5 mg GM、G和MA分别溶于D.0，用高分辨率超导NMR检测三者的结构构象，并对比。2）SEM：分别扫描GM的断面和表面，观察其表面形貌。
1.2.3制备GM水凝胶用60℃的PBS将GM配成质量分数10%的溶液，0.02 um滤器过滤除菌后，转入超净台内操作。取10 mL该溶液，加入50 mg光引发剂充分混匀，配成GM水凝胶准备液。取1 mL GM水凝胶准备液置于六孔板中，放入紫外交联仪，选择光强8 mW·cm-2、365 nm条件下辐照10 min，GM准备液聚合成GMTk凝胶。
1.2.4 GM水凝胶的力学性能质量分数10%的GM准备液制备成的直径约50 nm，厚度大于1 mm的GM水凝胶设为实验组，质量分数10%G溶液制备成的G凝胶设为对照组，规格同上。选用37℃恒温-频率扫描模式，用流变仪检测2组的黏弹性，间接反映2种材料的力学性能。
1.2.5培养hDPC取临床18-25岁患者因阻生需要拔除的健康完整的牙齿（四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准且患者知情同意），参照Gronthos采用的取材方法，在无菌条件下劈开牙齿，取出牙髓组织，切除根尖1/3部分，PBS反复冲洗；将牙髓组织剪碎成小于1 mmx1mmx1mm的组织块，含3 g·L-1的I型胶原酶和4 g·L-1的分散酶溶液于37℃水浴锅中消化组织块30 min，离心5 min、弃上清，含20%FBS的u-MEM培养液调整细胞密度，混匀后接种于25 cm22培养瓶中，37℃、5%CO2温箱中培养2 d，半量换液，然后每3 d更换培养基1次。待细胞生长融合达80%时，0.25 g·L-1胰酶消化传代，按1×105个·mL-1细胞数接种传代后培养。
1.2.6 GM水凝胶的细胞毒性和生物相容性1）直接法：取第三代hDPC，用无菌的GM水凝胶准备液制备成细胞浓度为1×106个，mL-I的.细胞悬液，在紫外光聚合反应中形成细胞GM水凝胶，随后转移至已添加培养基的六孔板中，常规培养3 d之后，在光镜下观察细胞生长状况。2）间接法：以GM水凝胶：DMEM培养基=0.2 g：1 mL的比例，密封后置于细胞培养孵箱中3 d，提取GM水凝胶浸提液作为A组；用同样的方法处理DMEM培养基作为B组。A、B两组液体分别加入10%FBS，1%双抗，培养hDPSC。3 d后小心弃去孔板中的培养基，PBS清洗后加入数滴0.4%台盼蓝溶液，室温下染色，5 min后吸出染液，PBs清洗残留染液，光镜下观察蓝染细胞，评估GM水凝胶的细胞毒性。CCK-8法测A组和B组培养7 d的细胞增殖曲线，从而评估GM水凝胶对细胞增殖的影响。
2.结果
2.1 GM的制备与表征
MA改性明胶在光引发剂引发下，经紫外光辐照后形成水凝胶。GM冻干后肉眼可见呈疏松多孔结构，易溶于水，SEM扫描断面可见大小均一数量颇多的孔隙结构（图1左），孔径大约10 um，而表面的图像也能看到致密多孔（图1右），孔径15-25 um，这种结构在形成水凝胶仍然会保持，孔隙会增大，有利于细胞的黏附长入，并且可保留大量水份支持细胞的营养代谢。从NMR图像（图2）上来看，可以看到GM结合了MA的甲基，在（5～6）×10-6处形成了代表特征性的MA酰胺结构的峰，而改性前后明胶特异性的谱图基本保持一致，说明改性对明胶的整体分子结构没有重大影响。
2.2GM水凝胶的力学性能
在使用流变仪测量过程中，GM水凝胶的形态没有出现明显变化，而G凝胶在37℃恒温测量台上已经变成溶胶状态。测量结果如图3所示，在0.01-100Hz的频率扫描模式下，GM水凝胶储存模量接近于明胶的10000倍，说明GM水凝胶具有弹性，在一定的范围内，随着频率的增加，GM水凝胶的弹性模量和损耗模量几乎保持不变。而G凝胶则明显不同，弹性模量与损耗模量则随着频率的增加而大幅度增加。说明在经过甲基丙烯酸改性之后，减少了明胶分子链之间的滑动，弹性模量和损耗模量受频率的影响大大降低（图3）。
2.3GM水凝胶的细胞毒性和生物相容性
用CCK-8测量7 d的增殖曲线（图4），可见GM浸提液培养的细胞增殖速度略低于DMEM培养基，但基本保持逐渐递增的趋势，说明GM水凝胶对hDPC无明显毒性抑制作用，在一定程度上能维持细胞的生长。
将牙髓细胞-GM准备液悬液经紫外光引发聚合形成细胞GM水凝胶，培养2 d后观察到细胞能在凝胶中维持基本形态。用GM水凝胶浸提液培养细胞，与普通DMEM培养基对照，2 d后用台盼蓝染色，死细胞被染成蓝色，镜下可见少有细胞蓝染，其余细胞形态良好（图5）。
3.讨论
牙组织工程是时下研究热点之一，组织工程牙髓再生能够规避传统根管治疗的弊端，恢复牙髓的支持营养功能，避免牙髓丧失造成的牙体变脆崩裂。以往研究中用HA-TCP支架材料复合牙髓细胞再生牙髓牙本质复合体，在裸鼠皮下得到了很好的效果，但原位再生研究要考虑牙齿根管系统形态多样，错综复杂，应该选用一种可以任意塑形，和天然牙髓组织相近的支架材料，使种子细胞呈三维生长，从而构建再生牙髓。
明胶的分子构象为杂乱的多肽链，侧链上有大量的羟基、羧基和氨基。本研究利用MA与侧链上的氨基结合形成MA酰胺结构，可以使明胶的一些理化性能得到优化，比如增加了多孔性，且在紫外光引发下能聚合成水凝胶。GM形成凝胶态后，表面依然保留多孔结构，孔径约为100um，牙髓细胞接种后能较好地黏附、长入、形成三维生长的模型。采用紫外光引发聚合形成的GM水凝胶在37℃条件下性能稳定。用流变仪测量力学性能，GM水凝胶能在0～100Hz的频率递增条件下保持高水平的稳定，机械性能大大优于普通明胶。说明GM水凝胶可以在体内实验中保持稳定，抵抗一定的机械作用力。另一方面，通过浸提液培养法及CCK-8法检测，间接证明了本材料具有良好的生物相容性。光镜下观察牙髓细胞能在水凝胶中均匀分布，活性良好。牙髓组织需要丰富的血供，而曾有研究使用GM水凝胶构建微血管，证明了它的可行性。最重要的一点，这种水凝胶的力学性能以及多孔性可以随着反应条件的改变而调节，凝胶时间也可以通过光引发剂的浓度而变化，这为后期的体内实验以及具体应用上提供了一定灵活的空间。综上所述，这种MA改性明胶水凝胶有望成为一种良好的牙髓再生组织工程支架材料。
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