谈白芍提取物对经前期综合征肝气郁证模型论文
白芍性微寒，味苦酸。归肝、脾经。功能养肝血，补肝阴，抑肝阳，为促进肝主疏泄调畅情志活动的重要中药之一。现代中医药研究中，常用白芍来治疗抑郁症，无论在组方频次和用药剂量上，白芍都占有重要地位。本实验室也已通过旷场实验和糖水偏好实验等行为学指标证实白芍提取物能够改善PMS 肝气郁证模型大鼠的抑郁样行为(尚未发表)，并且对以白芍提取物作为君药的舒郁胶囊在5-HT3R 水平干预肝气郁证及PMS 肝气郁证的作用机制也有诸多研究[2,3]。本文以PMS 肝气郁证为动物模型，用白芍提取物进行药物干预，旨在探讨白芍提取物在5-HT3R 水平改善抑郁样行为的作用机制。
1 材料
1.1 动物
健康雌性Wistar 大鼠，180-200 g，由山东中医药大学实验动物中心提供，许可证号: SCXK(鲁)2011-0003。
1.2 药品与试剂
白芍提取物(青岛阳光海川医药科技发展有限公司生产，含芍药总苷35%)。兔抗大鼠5-HT3AR 多克隆抗体(Abcam，ab51950)，5-HT3A 二抗(Abcam，ab-16248);羊抗大鼠5-HT3BR 多克隆抗体(SantaCruz，sc-51198)，Anti-HTR3B(MFG40388)，驴抗山羊5-HT3B 二抗IgG-HRP(Santa Cruz，sc-2020);β-actin一抗(Sigma，A1978)，β-actin 二抗(Santa Cruz，sc-2005)。碧云天cy3 标记驴抗山羊IgG(H+L)(AO505)，Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG(H+L)(AO423)。
1.3 仪器
主要仪器有：共聚焦显微镜ZEISS LSM710;切片机(Thermo Scientific Microm HM 340E);电泳仪、蛋白印迹转移装置(SDS-PAGE，美国伯乐公司);硝酸纤维素(NC)膜(美国PALL 公司，批号：T03157)。
2 方法
2.1 PMS 肝气郁证大鼠模型复制及给药
利用慢性束缚应激法制备模型，将筛选合格的大鼠分为3 组， 每组12 只，即正常组对照组(Normal)、PMS 肝气郁证模型组(Model)和白芍提取物组(Paeoniae alba extract)。除正常对照组外各组共接受5 天的慢性束缚应激刺激，期间每天给予白芍提取物36 mg·kg-1(相当于芍药总苷12.6mg·kg-1)，相当于临床成人的8 倍剂量;正常组和造模组均给予等量生理盐水。
2.2 脑组织取材
将各组大鼠(每组6 只)，断头处死，于冰块上迅速剥离额叶，放置于-80℃冰箱western blot 实验备用;另外每组6 只大鼠用戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)麻醉后，固定于鼠板上，打开胸腔，先用生理盐水速灌冲洗血液，再用固定液(4% 多聚甲醛-0.1 mol·L-1PBS pH 7.4)进行心脏灌流。至大鼠身体僵直后，迅速剥离鼠脑，切取所需的`额叶，置于上述固定液中，4℃保存过夜，常规洗涤脱水，石蜡包被，切片后用于免疫荧光双标记实验。
2.3 免疫荧光技术检测大鼠额叶5-HT3AR、5-HT3BR分布
将石蜡切片进行常规脱蜡，用微波炉进行抗原热修复，纯水冲洗后滴加正常山羊血清室温封闭 60min;滴加一抗稀释液(1?400)，4℃ 过夜。PBS洗涤，滴加荧光二抗混合液(1?500)，室温避光孵育 2 h，PBS 充分洗去未与一抗结合的荧光二抗及未与核结合的DAPI。洗涤完毕后，擦干载玻片组织周围水分，在组织旁滴加两滴甘油，盖玻片封片后，可分别置于低倍激光共聚焦显微镜(10×10)和高倍显微镜(10×40)下观察5-HT3AR、5-HT3BR 在额叶的分布状态及同位点表达情况并拍照。
2.4 Western blot 检测大鼠前额皮层5-HT3AR、5-HT3BR 蛋白表达
2.4.1 蛋白提取及定量
从-80℃冰箱取出保存的额叶，冰浴中操作，按1?100 的比例(mg·μL-1)加入提前预冷的 RIPA 裂解液，用匀浆器匀浆30 s，4℃离心机12 000 r·min-1离心15 min，吸取10 μL 上清液，用Bradford 法测定蛋白含量;按 4?1 在上清液中加入 5×SDS 上样缓冲液，置于沸水浴中5 min 使蛋白变性，再用离心机12 000 r·min-1 离心5 min，取上清液，分装，置于-20℃冰箱保存备用。
2.4.2 Western blot 测定额叶5-HT3AR、5-HT3BR 表达
以45 μg 额叶总蛋白每泳道上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，湿法转移至NC 膜上，用含5% 脱脂奶粉的TBST 溶液室温封闭2 h，分别与相应的一抗(Anti-5-HT3B，1?400;Anti-5-HT3A，1:400)和 β-actin 一抗(1?1 500)室温摇床孵育 4℃过夜，TBST洗膜3 次，每次5 min，再加入各自相应的二抗(Anti-5-HT3A，1?400;Anti-5-HT3B，1?400)，室温孵育2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次50 min，ECL 化学发光试剂检测杂交信号，显影于X 线片上，用凝胶成像分析仪在可见光透射下对X 线片进行扫描和图像分析。5-HT3AR 和5-HT3BR 与内参β-actin 做灰度比值，以此作为所测样品中相应指标的相对表达量。
3 结果
3.1 各组大鼠额叶5-HT3AR 和5-HT3BR 的表达情况
各组大鼠额叶5- HT3AR 和5- HT3BR 阳性细胞分别呈红色、绿色荧光，二者共表达呈黄色，细胞核为蓝色荧光，分布模式无明显差别，额区阳性细胞分布都比较均匀，多分布于细胞膜，细胞形态多为点状或圆形。
3.2 额叶5-HT3AR 蛋白表达结果
以β-actin 为内参，5-HT3AR 蛋白表达量的光密度扫描显示见图2，与正常对照组相比，PMS肝气郁证模型组5-HT3AR 蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与PMS 肝气郁证模型组相比，白芍提取物给药组5-HT3AR 蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，且趋于正常水平。
3.3 额叶5-HT3BR 蛋白表达结果
以β-actin 为内参，5-HT3BR 蛋白表达量的光密度扫描显示见图2，与正常对照组相比，PMS 肝气郁证模型组5-HT3BR 蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与PMS 肝气郁证模型组相比，白芍提取物给药组5-HT3BR 蛋白表达水平有下降趋势但无统计学差异。
4 讨论
中枢神经系统5-HT3R 亚型参与抑郁、焦虑、药物戒断症状等病理过程。前期研究也证明抑郁证模型大鼠及郁怒情绪模型大鼠异常情绪的发生跟海马及下丘脑5-HT3BR 蛋白水平异常升高有关。本研究发现PMS 肝气郁证模型额叶5-HT3AR、5-HT3BR蛋白表达明显增加，证实了该受体与PMS 肝气郁证抑郁情绪密切相关，这与本实验室前期研究抑郁情绪模型大鼠血清培养的海马神经元5-HT3AR、5-HT3BR 蛋白表达异常升高相吻合，由此推测PMS 肝气郁证在5-HT3R 水平的发病机制可能与5-HT3AR、5-HT3BR 蛋白表达水平异常有关。5-HT3AR 为功能性受体，5-HT3R 其它亚基均不能形成单独功能性受体，至少需要A 亚基共表达才能形成功能性作用。本实验实验结果显示白芍提取物能下调PMS 肝气郁证抑郁情绪导致异常升高的5-HT3AR 蛋白表达，而对5-HT3BR 蛋白表达的异常增加无明显逆转，这可能与5-HT3AR 表达广泛，而5-HT3BR 表达则相对较低有关系。现代研究显示芍药总苷能通过调控5-HT 能系统发挥其抗抑郁样行为的作用5-HT3R拮抗剂有抗抑郁样作用。
本实验白芍提取物能下调则PMS 肝气郁证抑郁情绪模型大鼠5-HT3AR 蛋白表达异常增加，可以推测白芍提取物可能直接发挥了5-HT3R 拮抗剂的作用。又有研究表明5-HT3R 拮抗剂可以加强5-HT再摄取抑制剂的抗抑郁作用。由此可以推测，白芍提取物也可能是通过改变其他内源性化学物质的含量或结合活性，继而影响了5-HT3AR 的蛋白表达，从而间接发挥了白芍提取物的抗抑郁样行为作用。有研究表明芍药苷的抗抑郁作用通过发挥钠离子、钙离子和钾离子拮抗剂的功能来实现，而5-HT3R 通道激活后为非选择性阳离子通道，即对钠离子、钾离子和钙离子均可通透，但其对钙离子的通透性随亚基种类不同而异。由此可见，为进一步探索白芍提取物抗抑郁情绪的作用机制，不仅要探讨5-HT3R 亚型的蛋白表达变化，还要继续研究白芍提取物发挥其抗抑郁情绪的作用与5-HT3R 通道电流的关系。
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