研究逍遥散乙醇提取物的乙酸乙酯谱效关系论文
中药的“谱- 效”关联是指构建中药的“谱”和适合的药效评价模型，采用数据处理技术将图谱数据和药理学数据进行关联，建立谱- 效关系。测定1H-NMR 谱图需要较少样品，扫描时间短，容易获得，因此被广泛应用。1H-NMR 图谱可以客观、全面地反映中药化学成分的特征。陈璟等在当前中药指纹图谱谱效相关性研究思路的基础上提出了基于“工艺- 指纹图谱- 效应”研究模式。目前常用的谱- 效关系分析方法主要有灰度关联分析、相关分析、回归分析和聚类分析。逍遥散出自宋代《太平惠民合剂局方》，由柴胡、当归、白芍、白术、(炙)甘草、茯苓、干姜和薄荷8 味药材组成，现代临床以及药理研究表明逍遥散有明显的抗抑郁作用。本课题组前期研究发现逍遥散低极性组分抗抑郁作用明显，采用灰度关联分析和相关分析对XYE-E 的谱效关系进行研究，表征其药效物质基础，为逍遥散的新药效开发提供依据。
1 材料和试剂
1.1 植物材料
逍遥散药材组成为：柴胡30 g，当归30 g，白术30 g，白芍30 g，茯苓30 g，甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g;以上药材均购自山西省华阳药业有限公司，经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为正品。
1.2 仪器和试剂
RE-52A 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);Bruker 600 MHz Avance Ⅲ NMR 谱仪(德国Bruker公司);Centrifuge TDL-5 型离心机(上海安亭科学仪器厂);BSA124S 分析天平(SI 德国赛多利斯公司);温度计;计时器;有机玻璃缸等。盐酸文拉法辛胶囊(25 mg/ 粒，批号120401，成都康弘药业集团股份有限公司);氘代甲醇(99.8%，德国默克公司)。
1.3 动物
雄性ICR 小鼠，SPF 级，动物许可证号：SCXK(京)2011-0012，18~22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物自然昼夜节律光照，适应1 周后进行实验。
2 方法
2.1 XYE-E 的制备
XYE-E 按照以下工艺进行制备: 处方量的逍遥散药材，加入8 倍量75% 乙醇回流提取1.5 h，滤过，滤液浓缩至一定量后，加等倍量的乙酸乙酯萃取，振摇0.5 h，静置0.5 h，共萃取3 次，合并萃取液，浓缩，蒸干得XYE-E。
2. 2 XYE-E 的1H-NMR 图谱测定
称取XYE-E 约25 mg，加700 μL 氘代甲醇溶解，溶解液转移至1.5 mL 离心管中，13 000 rpm 转低温离心10 min，移取600 μL 上清液于核磁管中，平行制备6 份，进行1H-NMR 测定。XYE-E 在25℃下于600 MHz NMR 仪上测定(频率600.13 MHz)，采用ZG30 序列，扫描次数为64，脉冲间隔为1.0 s，延迟时间为5.0 s。氘代甲醇(δ 3.30 ppm)用于锁场和定标。
2.3 小鼠悬尾实验[
雄性ICR 小鼠适应1 周后，随机分为3 组，每组12只，分别为空白组，阳性组(盐酸文拉法辛0.05 g·kg-1)，XYE-E 组(生药46 g·kg-1)。XYE-E 使用前用0.5%CMC-Na 与0.5% 吐温80 混合物稀释至相应浓度，盐酸文拉法辛使用生理盐水稀释至同等浓度，各组灌胃给药20 mL·kg-1，空白组给予等量色拉油，连续14 d。末次给药1 h 后，将小鼠尾尖1 cm 处黏贴于悬挂钩上，并且手托小鼠将其挂入动物行为视频分析系统观察箱中，记录6 min 内小鼠的绝望行为，分析后4 min 内小鼠的不动时间。
2.4 小鼠强迫游泳实验
动物分组及给药同“2.3”项下。末次给药1 h 后，用动物行为视频分析系统记录6 min 内小鼠的游泳行为状况，分析后4 min 内小鼠的不动时间。
2.5 数据分析核磁图谱
采用MestReNova 进行处理。谱- 效的数据处理采用相关分析(SPSS 16.0)和灰度关联分析。
3 结果与分析
3.1 药效学评价
XYE-E 对小鼠悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间的影响，XYE-E 能减少小鼠悬尾实验和强迫游泳实验中的不动时间，与空白对照组比较均具有显著性差异(P < 0.01)，表明XYE-E具有明显的抗抑郁作用。
3.2 XYE-E 特征峰的选择与定量
为XYE-E 的1H-NMR 图谱，根据文献共指认出14 种化学物质，分别为柴胡皂苷类，阿魏酸，藁本内酯，白术内酯，芍药苷，甘草苷等物质。在1H-NMR 图谱中，共振峰面积或峰高与产生该共振峰的质子数成正比，这是定量的依据，在没有对照品时，可利用特征峰相对含量法对物质的含量进行宏观分析。用于定量分析的特征峰应不受其他信号干扰，并且达到特征峰两侧的基线平坦。对提取物核磁图谱采用0.01 分段积分、归一化处理后，分别求算14 种化学物质特征峰的相对峰面积，用相对峰面积表示物质的相对含量。
3.3 灰度关联分析
为了进一步研究逍遥散提取物中14 种活性成分对抗抑郁作用的贡献大小，进行了灰度关联分析。令Y=(y1,y2,......,yn) 为药效数据向量，Si=(Si,1,Si,2,......Si,n) 为相对峰面积数据向量，其中i=1,2,......,m)。(1)原始数据变换：将各原始数据除以该列数据的.均值，进行规格化处理。(2)计算灰色关联系数：其中;△ij=|yi-sij |(3)计算灰色关联度：(4)排列顺序：XYE-E 的1H-NMR 图谱与FST 和TST 不动时间的灰度关联分析结果，依据关联度的大小，确定了各成分对抗抑郁作用贡献的大小顺序，其中白术内酯Ⅰ，白术内酯Ⅱ，柴胡皂苷a，柴胡皂苷c，柴胡皂苷E，柴胡皂苷F，柴胡皂苷G，柴胡皂苷b2与药效相关度较高(相关度大于0.700)。
3.4 相关分析
将1H-NMR 图谱中指认化学物质的相对峰面积与其FST 和TST 不动时间的数据进行相关性分析，利用SPSS 16 统计软件进行双变量相关分析法(Bivariate)，分析结果见表3。从表3 可以看出，柴胡皂苷d 和柴胡皂苷E 与FST 不动时间的相关性较高(P<0.05，P<0.01);柴胡皂苷b2，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷G 与TST 不动时间的相关性较高(P<0.05，P<0.01)。与灰度关联分析的结果一致，说明柴胡皂苷是逍遥散中发挥抗抑郁作用的主要成分，同时也证实了柴胡在逍遥散中的君药地位。
3.5 强迫引入回归分析
采用SPSS 中多元线性回归分析中的强迫引入法(enter)对相关性大的化学成分(P<0.05)进行多元回归分析，以有效成分峰面积作为自变量，FST和TST 不动时间为因变量，建立方程。在14 个色谱峰中X4(柴胡皂苷d)、X6(柴胡皂苷E)、X8(柴胡皂苷G)3 个与药理数据密切相关的色谱峰被引人回归方程。所得方程为：YFST= -90.88-210.88X4+1 496.32X6(F=18.437，P=0.021，R2=0.925)Y T S T= - 1 2 7 3 . 2 5 + 7 9 3 2 . 7 9 X 8 ( F = 1 0 . 6 7 7 ，P=0.031，R2=0.727)FST 和TST 模型拟合后的决定系数R2 分别为0.925 和0.727，即变量的变差可以解释全部抗抑郁药理活性变化的93% 和73%。模型的方差分析均显示P<0.05，说明此回归模型有统计学意义。FST 和TST 残差的分布结果符合正态分布假设，预测值的累积概率与观测值的累积概率的散点基本散布在直线上，说明自变量与因变量之间符合线性关系，并且标准化残差在0 的附近波动，满足残差的方差齐性条件。强迫引入法分析结果显示柴胡皂苷d，柴胡皂苷E，柴胡皂苷G 所对应的化学成分对FST 和TST 不动时间具有较大影响。结合灰度关联分析和相关分析研究，表明柴胡皂苷d、柴胡皂苷E 和柴胡皂苷G 与药效的相关性最大，但是其余未指认的色谱峰所对应的化学成分是否有抗抑郁作用，有待于进一歩研究。
4 讨论
XYE-E 的1H-NMR 图谱包含了XYE-E 中所有物质的氢信号，通过对1H-NMR 指纹图谱中的特征峰进行分析，共指认出14 种化合物，包括柴胡皂苷类物质，白术内酯类物质以及甘草苷、芍药苷等。谱效关系研究可以发现和跟踪药效物质，指导制备工艺的优化，保证中药的临床疗效。本研究发现与XYE-E 抗抑郁药效密切相关的物质主要是柴胡皂苷，甘草苷和芍药苷与抗抑郁药效相关度并不高。采取不同提取分离工艺所得提取物的化学组分和含量均不同，从而引起图谱特征信息变化和相关药效的改变。中药化学组成复杂，单张化学图谱难以完整地反映中药的化学组成特征，因此建立多源谱效关系，完整表征中药复方的整体化学特征显得尤为重要。本研究中未被指认的色谱峰需进一步分析，对XYE-E 中的化学成分进行更深入的分析和谱效关系研究。
综上所述，中药复方谱效关系的研究对于优化中药生产工艺，追踪和筛选药效活性成分，加快中药新药研究等方面具有重要的推动作用。
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