稻曲毒素含量与致病力关系探析论文
材料与方法
粗毒素的提取。刮取1g新鲜稻曲球外层的厚垣孢子粉末，分别用水﹑甲醇和丙酮各80mL振荡60min提取。超声30min，双层滤纸过滤，将滤液真空旋转浓缩获得的浆状物即为粗毒素。每种提取方法各重复3次。
粗毒素的生物活性测定。9cm灭菌培养皿内衬双层灭菌滤纸，用7mL毒素液（按1.1中所得粗毒素浆状物用水稀释定容至25mL）浸湿滤纸，对照加清水；小麦种子（扬麦158）用次氯酸钠进行表面消毒90s，无菌水冲洗后置于培养皿内，每皿20粒，28℃培养4d，酌情保湿，每皿调查15粒麦粒根长，每个处理重复3次。整个试验重复2次。胚根伸长抑制率=[（对照胚根平均长度-处理胚根平均长度）/对照胚根平均长度]×100%。
粗毒素的组分分析。HPLC检测粗毒素用水稀释经0.45μm微孔滤膜过滤后通过高效液相色谱仪Agilent1200进行分析。检测器为可变紫外波长检测器（VWD）；色谱柱为EclipseXDB-C18（4.6×250mm，5μm）；流动相为水-甲醇-甲酸（400﹕70﹕1，V/V）；流动相流速为0.8mLmin-1；柱温为40℃；样品进样量为20μL；紫外检测波长为254nm。1.3.2质谱分析将粗毒素用水稀释经0.22μm微孔滤膜过滤后通过ESI源的Agilent6410三重四级杆质谱仪进行分析。质谱条件：ESI源（+）；气体温度350℃；气体流速10Lmin-1，雾化器压力45psi；毛细管电压（capillaryvoltage）4000V；碎裂电压：135.0V；175.0V；200.0V；扫描范围m/z100—800。
稻曲毒素A检测方法。对全国5个稻区的224份稻曲球样品进行毒素A含量检测。刮取每份稻曲球样品的厚垣孢子，充分混匀后称取其中0.1g粉末作为待测样品，按照1.1的方法用水提取稻曲毒素A，按照1.3.1的方法进行HPLC检测。因为没有稻曲毒素A标准品，以1份采集自南京的稻曲球粉末作为参照样品，连续检测5次取平均峰面积M。每检测5份样品的同时就检测参照样品，在参照样品峰面积稳定（M±10%之内认定为稳定）的前提下检测数据认定有效，所以比较每份样品的峰面积就能够相对比较出样品真实含量的相对高低。
稻曲菌致病能力测定方法。田间试验于2010年和2011年在江苏省农科院溧水基地试验田中进行。按照张君成等[15]方法对实验室保存的52株稻曲菌进行致病力测定。挑取已单孢纯化的稻曲病菌株转接到PSA培养基上，28℃下培养15d。取菌株生长边缘处用直径为3.5mm的打孔器打孔，取12个菌丝块放入装有20mLPS培养液的50mL离心管中，在28℃、130r/min下振荡培养，7d后将含有孢子和菌丝的混合液接种。用注射器注射，每穗1mL，每个菌株接种10穗，接种后做上标记。在收割前15d调查接种结果，每株稻曲菌调查8穗的稻曲球数及病穗数，进行病害发生程度的分级。分级标准参考唐春生等[16]方法。病指计算方法：病情指数=（各级病穗数×相应的级数）（/调查总穗数×最大病级数）×100。1.6稻曲菌产毒素A量与致病力相关性分析采集每株稻曲菌致病产生的所有稻曲球刮取厚垣孢子，充分混匀后称取其中0.1g粉末作为待测样品，按照1.4进行检测。用SPSS17.0分析软件画出菌株产毒素A量与其致病力的散点图，计算其相关系数，并根据相关系数大小分析相关程度：R＜0负相关；R=0无线性相关；|R|＞0.95显著性相关；|R|＞0.8高度相关；0.5≤|R|＜0.8中度相关；0.3≤|R|＜0.5低度相关；|R|＜0.3关系极弱，认为不相关。显著性概率P＜0.05为差异有统计学意义。
结果
不同提取方法所得稻曲菌粗毒素的生物活性。分别用纯水、甲醇和丙酮3种极性不同的溶剂提取，获得的粗毒素对小麦胚根生长的抑制程度不一。其中，纯水和甲醇提取所得粗毒素对小麦胚根伸长的抑制活性较强，抑制率分别达59.6%和52.9%，二者无显著差异；丙酮提取所得粗毒素处理与CK无显著差异。
稻曲菌粗毒素及其主要活性组分分析。将3种提取方法所得粗毒素用纯水稀释，过0.45m微孔滤膜后进行HPLC检测，并对每个色谱峰用VWD进行了紫外扫描。比较水-甲醇-甲酸、水-甲醇-乙酸和水-甲醇-磷酸作为流动相，发现磷酸的色谱峰型最好，甲酸次之，乙酸最差。考虑到后续的样品纯化工作需要尽量保持分析型HPLC和制备型HPLC工作条件的一致，本研究采用水-甲醇-甲酸流动相系统。同时比较了不同体积比的水-甲醇的分离效果，测定结果表明，当流动相中水-甲醇体积比为400﹕70时，各种组分分离效果和重现性最好（图1）。甲醇和水提取获得的粗毒素色谱图中疑似稻曲毒素A的11.394min组分（图略）和11.385min组分（图1，组分ii）峰面积相当，但水提取的峰形较好且前期杂质较少。丙酮几乎没有提取出疑似组分。色谱图结果与生物毒性试验结果一致。分别对甲醇和水提取获得的疑似组分进行紫外扫描，发现扫描结果几乎完全一致：均有3个吸收峰，分别在207、254、290nm（水提取紫外扫描图见图2，甲醇提取图略），与已报道文献中稻曲毒素A的紫外特征吸收相吻合[5,9]。因为稻曲球厚垣孢子中含有大量脂溶性的色素杂质，但用纯水提取又会出现厚垣孢子粉末漂浮在提取液面之上不能充分浸入液体的问题，所以在后续的研究中采用纯水中加少量甲醇的方法提取稻曲毒素A。将粗毒素用纯水稀释后过0.22m微孔滤膜后进行LC-MS分析，总离子流图见图3，质谱图见图4。6.073min组分（Ⅰ）的ESIm/e为645.9（M+H）+、11.444min组分（Ⅱ）的ESIm/e为673.9（M+H）+、14.058min组分（Ⅲ）的ESIm/e为558.9（M+H）+、15.362min组分（Ⅳ）的ESIm/e为494.9（M+H）+，分别与国外已发表文献中的稻曲毒素B（M+H，646）、A（M+H，674）、C（M+H，559）、D（M+H，495）的相对分子质量基本一致[5]。由于质谱图（图3）中峰II的保留时间与高效液相色谱图（图1）中峰ii的保留时间极为接近，再结合紫外吸收光谱（图2），初步证明高效液相色谱图中的组分ii为稻曲毒素A。
不同地区稻曲球毒素A相对含量的比较及不同。地区稻曲菌产稻曲毒素A量与致病力相关性分析从全国5个稻区采集224份稻曲球样品，用HPLC检测样品中的毒素A的相对含量。检测结果（表1）表明，不同地区稻曲球的平均含量差异较大；其中四川地区的平均稻曲毒素A含量最高（995），是平均含量最低的江西（535）的1.86倍。不同地区的高含量样品所占比重差异也很大，在采集自四川的29份样品中有15份高含量样品，占51.7%；在采集自江西的21份样品中只有2份高含量样品，占9.52%。测定了来自全国7个省份52个稻曲菌菌株在感病品种两优培九上的产生致病反应和产毒素A量，结果表明（表2），52个稻曲菌菌株的致病性分化十分显著（病情指数7.5—100），产毒素A量也差异显著（最高产量是最低产量的2.7倍）。运用SPSS17.0分析软件，做出52个菌株产稻曲毒素A量和致病力（病情指数）的二维散点图（图5），其相关系数R=0.222，显著性概率P=0.114，无统计学意义。分析结果表明，稻曲菌菌株的产毒素A量与致病力相关性不显著。
讨论
植物病原毒素是植物病原菌产生的对寄主植物有毒性的代谢产物，在病原菌侵染致病定殖过程中常起到重要作用，是导致植物病害发生的'主要因素之一。康振生等[17]发现，当禾谷镰刀菌菌丝尚在寄主体表扩展而未侵入寄主细胞时，病菌已产生分泌脱氧镰刀菌烯醇毒素DON，随着寄主组织中DON浓度的升高，寄主细胞相应发生了一系列病理变化，寄主细胞坏死后病菌进入坏死的寄主细胞定殖。在病原菌毒素应用方面，目前已有多种病原菌毒素被应用于抗病品种筛选或抗病突变体筛选抗性评价[18-19]，而稻曲毒素在稻曲菌致病过程中所起作用尚未清楚，同时常规方法在稻曲病抗性评价上存在一定的局限性，已成为制约高抗病品种选育的主要因素之一。对稻曲毒素进行深入分析可为深入阐明稻曲菌的致病机理提供科学依据，为稻曲病抗病育种提供新的途径。
本研究室前期研究发现稻曲菌培养液中存在抑制小麦胚根生长的活性成分，但无论是用有机溶剂还是用水浸提都无法在高效液相上检测出稻曲毒素A，笔者转而从稻曲球中寻找毒素A，在提取溶剂的选择上发现水和甲醇都可以获得毒素A。本研究采用水中加少量甲醇的方法提取粗毒素，并用LC-MS对粗毒素中多种活性成分进行扫描，发现共有4种组分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），分别与国外已发表文献中的稻曲毒素B（M+H,646、A（M+H，674）、C（M+H，559）、D（M+H，495）的相对分子质量一致。由于质谱图中组分II的保留时间（11.444min）与HPLC色谱图中组分ⅱ的保留时间（11.385min）极为接近，再结合紫外吸收光谱（图2），初步证明高效液相检测出了稻曲粗毒素中的毒素A。
研究病原菌不同菌株产毒素A量与致病性分化之间的相关性对进一步明确病原菌的致病机理具有重要的参考价值。俞刚等[20]发现，禾谷镰刀菌的产毒能力与其致病力成正相关，不产毒的突变菌株对小麦等寄主的致病力显著低于野生型菌株，虽能定殖寄主，但所需时间较长，且不能造成典型病斑，更不能在寄主组织中扩展。桑茜等[21]发现不同黄萎病菌分离物分泌的粗蛋白含量存在明显差异，与其所致的病情指数呈显著正相关，且黄萎病菌强致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较强，弱致病力分离物分泌的粗毒素对棉苗的致萎力较弱。本研究用人工接种的方法，测定了52个稻曲菌株对感病品种两优培九的致病力，并采集每株稻曲菌致病产生的所有稻曲球，用HPLC检测等重量稻曲球粉末中稻曲毒素A含量。结果发现（表2）52株稻曲菌在两优培九上致病力分化和产毒素A量均差异显著，但是不同稻曲菌株的产毒素A量与致病力相关性不显著。由于采集稻曲球时病害已获得充分扩展，稻曲球中的毒素A含量的高低可能受到其它多种因素的影响，与致病力相关性很低。因此，深入研究接种稻曲菌后水稻植株内稻曲毒素A的动态消长与致病力的相关性或许更能说明到毒素A在病程中所起作用。另外，稻曲菌属于营养争夺型病菌，致病力越强的稻曲菌病粒率越高，单个稻曲球获得的营养就较少[16,22]，这对稻曲毒素A含量是否产生影响有待进一步研究。
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