PCR-双酶切鉴定STGC3抑癌基因重组子假阳性研究
目的:探讨PCR与双酶切技术联合使用鉴定阳性重组子的特异性和可靠性,评价长期保存的重组质粒再次测序的必要性.方法:对随机选取已经过测序验证的三组STGC3/pcDNA 3.1(+)、一组STGC3/pGEM Easy T Vector重组子首先经过LB氨苄平皿培养挑单克隆筛选,然后单独或联合使用PCR和双限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切方法鉴定,将阳性样品送交生物工程公司测序,比较并评价两者结果的一致性.结果:三组STGC3/pcDNA 3.1(+)重组子经PCR-双酶切检测阳性而不能通过测序,说明该检测方法在运用中确实存在假阳性,同时证明重组载体在长期保存后有必要再次鉴定.结论:保存过程中的杂菌污染、实验室操作中的质粒交叉污染以及重组载体基因突变是基因工程操作中不可忽视的问题;PCR-双酶切鉴定重组载体存在假阳性的问题,实验设计中应包含阳性与阴性(污染)对照,并有足够的重复实验.
