辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶及其选择性剪接亚型的表达与功能鉴定
目的:研究人肝脏中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)及其选择性剪接体NRDRiso的生物学功能. 方法:在BL21-AI菌中进行NRDR和NRDRiso表达,分离溶解包涵体.应用部分析因设计方法设计复性基质,并进行筛选.应用固相金属离子亲合层析技术(IMAC)和筛选出来的复性基质对变性的NRDR和NRDRiso进行复性和纯化.高效分子筛色谱分析复性后NRDR和NRDRiso的纯度及相对分子质量.高效反相液相色谱确定视黄醛还原酶活性,双倒数法测定酶促反应的Km和Vmax. 结果: NRDR和NRDRiso在BL21-AI菌中进行了高效表达,每毫升培养物可获得湿重为3.3 mg和1.2 mg的包涵体.经筛选确定4℃,225 mmol/L NaCl, 25 mmol/L KCl, 10%甘油, 1%蔗糖, 50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.5为最适复性基质.应用IMAC复性后,高效分子筛色谱分析表明NRDR和NRDRiso得到较好的复性,相对分子质量分别为31.57×103和20.46×103.NRDR具有视黄醛还原酶活性,其催化酶促反应的Km和Vmax分别为(2.7±0.18)μmol/L和(0.357±0.047)μmol/(mg·min).NRDRiso未检测到视黄醛还原酶活性. 结论:建立了对NRDR和NRDRiso变性蛋白进行复性方法,确定NRDR具有辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶活性,NRDRiso生物学功能有待进一步研究.
作 者： 刘戈飞 黄东阳 LIU Ge-Fei HUANG Dong-Yang 作者单位： 汕头大学医学院分子生物学中心,汕头,515041 刊 名： 军事医学科学院院刊 ISTIC PKU 英文刊名： BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES 年，卷(期)： 2006 30(3) 分类号： Q593.1 关键词： 视黄醇脱氢/还原酶 选择性剪接 复性 活性