大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选
目的构建脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用后的肺泡巨噬细胞(AMs)酵母双杂交cDNA文库,探寻炎症条件下与糖皮质激素受体(GR)相互作用的蛋白质分子.方法用LPS(10mg/ml)和Dex(10-5mol/L)作用于原代培养的肺泡巨噬细胞4h后,从肺泡巨噬细胞中提取总RNA,再以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的双链cDNA,后者纯化后,与线性质粒pGADT7-Rec共转化感受态酵母菌AH109,二者在酵母细胞中同源重组成环形的有复制活性的cDNA文库质粒,收集在缺亮氨酸(Leu)培养板上筛选出所有克隆,即为AMs酵母双杂交文库菌.进而通过诱饵质粒pGBKT7-GR转化构建成功的文库菌,筛选与GR相互作用的蛋白分子.结果构建了具有基因多样性和库容量足够大的AMs cDNA文库,共获得1.07×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3～1.5kb之间.筛选文库获得1个真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆为BAG-1.结论利用Clontech SMART技术成功构建了肺泡巨噬细胞的酵母双杂交cDNA文库;GR与BAG-1在酵母细胞中存在着相互作用.
作 者： 张方 施毅 辛晓峰 刘玉秀 宋勇 钱桂生 罗向东 赵明 李子玲 作者单位： 张方,施毅,辛晓峰,宋勇,赵明,李子玲(210002,南京,南京军区南京总医院呼吸内科)刘玉秀(210002,南京,南京军区南京总医院科研科)
钱桂生(第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所)
罗向东(第三军医大学西南医院烧伤研究所)
刊 名： 解放军医学杂志 ISTIC PKU 英文刊名： MEDICAL JOURNAL OF CHINESE PEOPLE'S LIBERATION ARMY 年，卷(期)： 2006 31(5) 分类号： Q785 关键词： 受体,糖皮质激素 巨噬细胞,肺泡 基因文库 酵母双杂交