TCB4-1细胞培养技术+-2-
第四章
细胞培养技术
1
Outline
1.
2.
3.
4.Animal cell cultureHuman cell cultureStem cell cultureTumor cell culture
2
Deng XB, et al., Apoptosis. 201143
Animal cell culture
?Primary culture
Sensitive
Complex
?Cell line
ATCC (American Type Culture Collection)
4
动物原代细胞培养技术
?动物细胞与组织培养
是从动物体内取出细
胞或者组织，模拟体
内的生理环境，在无
菌、适温和丰富的营
养条件下，使离体细
胞或者组织生存、生
长并维持结构和功能
的一门技术。
5
6
每代贴附生长细胞的生长过程?游离期
?贴壁期
?潜伏期
?对数生长期
?停止期（平台期）
7
8
游离期：
细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
9
10
贴壁期：
?细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10 min－4 h贴壁。
底物：胶原、玻璃、塑料、其他细胞等。?血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。?进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的
11功能基团）。
12
潜伏期：
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。13
倒置显微镜
?一般观察：
?培养液颜色（CO2、pH指示剂）桃红色－正常；橙黄色－较好；
淡黄色－时间过长、营养不足、细胞死亡紫红色－死亡
?细胞透明度
颗粒物、空泡、胞膜
14
15
图受精卵的全能性
16
图植物细胞的全能性
17
What is the stem cell？
细胞在分化过程中往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞。一旦需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。
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?Tree of Embryon
Development
Mesoderm: 中胚层Endoderm: 内胚层Ectoderm: 外胚层Implantation: 植入Uterus: 子宫19
20
Totipotent cells: 全能细胞
Pluripotent stem cells:
多能干细胞
图干细胞的分化潜能
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分类
?按分化能力的大小，干细胞可以分为：
?全能干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。胚胎干细胞就属于此类，它具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，从而可以进一步形成人体的任何组织或器官。
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?专门型干细胞，只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。利用专门型干细胞培育人体细胞和组织的研究已经取得了一定成果，但利用前景更广阔的，还是分化能力最强的全能干细胞。如果能源源不断地获得这种全能干细胞，就可以在体外诱导产生不同的组织细胞甚至器官供移植。
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胚胎干细胞生物学特征：
?具有早期胚胎细胞相似的形态特征，核型正常，保留了正常二倍体的性质；?具有无限增殖的能力；
?具有发育的多潜能性；
?具有种系传递功能；
?具有培养细胞所有的特征，可在体外培养、克隆、冻存及进行遗传操作。
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材料
?PMSG（孕马血清）、HCG（绒毛膜促性腺激素）、DMEM 培养液
?2+无CaPBS 缓冲液；磷酸盐缓冲液（PBS 液）；0.125 %胰酶EDTA 混合液；丝裂酶素C2+、Mg
?胎牛血清、新生牛血清
?白血病抑制因子；干细胞生长因子；牛胰岛素
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方法
1.
2.
3.
4.
5.胚胎的获得与培养内细胞团的分离干细胞集落的分离干细胞的鉴定统计分析
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1. 胚胎的获得与培养
?胚胎分别来自体成熟的自然发情或超数排卵的雌性昆明白小鼠，129 品系小鼠（6 周龄）。检到阴道栓的早晨，记为015 dpc。分别于315 和4 dpc ，断颈处死孕鼠，取出子宫，用含5%NBS的PBS 液从子宫角冲胚胎。
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?在解剖镜下，把冲洗后的胚胎转移到铺有饲养层的培养板中，分别采用3 种不同培养液，即培养液1 : DMEM 液+ 10% NBS + 10% FCS培养液2 : 培养液1 + 1000 IU/ml IF
培养液3 : 培养液1 + 10 mg/ml 胰岛素
37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每天观察1 次，加、换液1 次，记录有关胚胎贴壁、内细胞团（inner cell mass, ICM）出现等生长情况。
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2. 内细胞团的分离
?胚胎接种到有饲养层的培养板中培养4～5 d 后，内细胞群（ICM ）长大，出现卵圆柱状或岛状形态，周围滋胚层细胞明显展开，此时应分离ICM。
29全能细胞
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?2+弃去原培养液，加入无Ca2+、Mg的PBS 液洗1 次。在解剖镜下剥去ICM 周围的滋胚层细胞，用吸管把ICM 转移到干净的培养皿中。加一滴胰酶于ICM 上，37℃，消化3 min。
?将ICM 转移到新的培养液中，用吸管吹打将其打散。把打散的细胞接种到有新鲜饲养层的培养板中，在37℃、5% CO2培养箱中继续培养。
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3. 干细胞集落的分离
?分散的ICM 细胞培养3～7 d 后，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。
?此时形成的干细胞集落为F1 代，在解剖镜下将F1 代干细胞集落挑出，按照ICM 分离法离F1代干细胞集落，再获得的干细胞集落称为F2 代，将F2 代干细胞集落挑出，再进行分离传代数次，直至获得纯净的ES 细胞集落。
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4. 干细胞的鉴定
?形态
?AKP （碱性磷酸酶）染色
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(1) 形态鉴定：
典型的干细胞
?体积较小，有一个大核和少量的细胞质。核中有一个或二个明显的核仁黑色结构。?细胞紧密成群，细胞界限不易区分。?在集落的边缘区域可以看到清晰的单个细胞。
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(2) AKP 染色鉴定：
?将待测细胞用含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛固定，?底物buffer（100 M Tris-HCl pH9.5，50 mmol/l NaCl MgCl2，0.11% Tween-20）平衡，室温避光染色：75 mg/ml nitroblue tetrazolium (NBT，硝基蓝四氮唑) 溶于70% dimethyl-formamide (DMF) ，50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-in-dolyphophate toluidinium salt (BCIP) 溶于100%DMF ，染色前分别取45 μl 、35 μl 溶于10 ml 底物buffer 中，新鲜配制。ES ( PGC、EG) AKP 染色被染为深蓝紫色，饲养层细胞、分化细
36胞不着色。
5. 统计分析
?SPSS
?Origin
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诱导多能干细胞（
Induced pluripotent stem cells, iPS cells
）
2007年11月20日，《细胞》和《科学》杂志几乎同时发表了来自日本京都大学的山中伸弥（ShinyaYamanaka）团队和美国威斯康星大学的詹姆斯·汤姆森（JamesThomson）/俞君英团队，通过插入四个特定基因，第一次成功地将普普通通的人体38皮肤细胞，直接改造为功能与胚胎干细胞类似的诱导多能干细胞（iPS）
iPS干细胞建立的过程主要包括：
1.分离和培养宿主细胞
2.通过病毒介导或者其他的方式将若干多个多能性相关的基因导入宿主细胞
3.将导入相关基因的细胞种植于饲养层细胞上，并于胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ES 细胞）专用培养体系中培养，同时在培养中根据需要加入相应的小分子物质以促进重编程
4.出现ES样克隆后进行iPS干细胞的鉴定（细胞形态、表观遗传学、体外分化潜能等方面）
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iPS干细胞的应用
?在基础研究方面
它的出现，已经让人们对多能性的调控机制有了突破性的新认识细胞重编程是一个复杂的过程，除了受细胞内因子调控外，还受到细胞外信号通路的调控。对于Oct4、Sox2和Nanog等维持于细胞自我新能力的转录因子的研究正在逐渐地展开；利用iPS干细胞作为实验模型，只操纵几个因子的表达，这更会大大加速对多能性调控机理的深入研究。
?在实际应用方面
iPS干细胞的获得方法相对简单和稳定，不需要使用卵细胞或者胚胎。这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势，iPS干细胞的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离，iPS干细胞在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。此外，iPS干细胞在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现，iPS干细胞在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等。在临床40疾病治疗中具有巨大应用价值。
Kyoto team generates kidney tissue from iPS cells间介中胚层（intermediate
mesoderm，IM）是位于轴旁中胚层
和侧中胚层之间的中胚层组织，可
分化为肾脏的主要器官，Osr1是IM
特异性的标志蛋白。该研究首先通
过同源重组的方式，构建Osr1-GFP
human induced pluripotent stem
cells (hiPSCs) 报告细胞。利用四
种方法诱导iPS细胞分化成IM细胞，
并通过Osr1-GFP进行追踪。从大鼠
胚胎内取出的肾脏细胞与IM混合培
养，最终成长为具有管状结构的组
织。该研究显示，利用iPS细胞可以
诱导分化成立体的肾脏器官
1. Generation of OSR1-GFP knock-in hiPSC lines
?首先将含有OSR1的BAC载
体转入E. coli 中
?之后将OSR1部分编码区替
换成EGFP和PGK-Neo
cassettes，再用Cre重组酶
将PGK-Neo去除，完成基
因的敲入
?用选择性培养基筛选已选
中的细胞。最后获得OSR1-
GFP敲入的.hiPSC细胞
42
2. Establishment of robust induction methods
of IM cells
43
?EB（embryoid body）method
a)
b)
c)当hiPSC细胞浓度达到80%时（10-cm的培养皿），用PBS冲洗细胞，在DMEM中加入1 mg/ml胶原酶IV，培养细胞10min 。用PBS冲洗细胞，换成stage1培养基对细胞进行培养（DMEM/ F12 +Glutamax ，500 U/ml双抗，2%FBS)将细胞接种到六孔板中，培养基为stage1，并添加100ng/ml 激活素A 和100ng/ml Wnt3a或1–3 mM CHIR99021。培养三天后将细胞转移至明胶培养皿上，培养20天。采用stage 2培养基（DMEM/F12 +Glutamax，0.1 mM 非必需氨基酸，500 U/ ml双抗，0.55 mM 疏基乙醇，10% KSR，100 ng /ml，BMP7 (R&D Systems) ，100 ng Wnt3a 或1–3 mM CHIR99021）。
?Colony method
a)
b)将生长在mouse embryonic ?broblasts (MEF) 培养层上hiPSC细胞分离出来（CKT溶液），在明胶培养皿中培养30min，去除MEFs，之后将细胞接种于人工基底膜培养皿中于ES培养基中进行培养。当细胞密度达到70%，按照EB method 的方法完成stage1，stage2的操作。
?Single-cell method
a)
b)hiPSC同样生长在MEF上，按照上述方法去除MEFs，用Accutase消化细胞使hiPSC形成单个细胞将细胞种于Collagen Type I-coated 培养皿中，按照按照EB method 的方法完成stage1，stage2的操作，其中在stage1培养过程中额外加入10 mM Y27,632
?Serum-free-cell method
采用无血清培养基DMEM/ F12 +Glutamax ，500 U/ml双抗，1×B27，其他步骤同Single-cell method
44
3. Characterization of developmental potential of
human IM cell
?hiPSC分化的
于24孔板中，用stage2的培养基并添加10 mM Y27,632 和10 ng/ml TGFβ1培养7天。
?从ICE小鼠的第11.5天的胚胎中取出后肾组织，之后用0.05%胰酶-EDTA 37℃作用10 min，用肾培养基进行培养10min ，然后过滤。
?10×104后肾细胞与之前处理的1×104 OSR1(GFP)+细胞混合接种于96孔板中。加入10 mM Y27,632，37℃过夜培养，形成聚合体。器官培养一周后，聚合体逐渐稳固。
45+OSR1(GFP)细胞培养11天后，接种
利用病人尿液细胞获得神经干细胞通过转染携带表达干细胞因子基因的载体的方式将一些干细胞因子导入从病人尿液中分离而来的细胞中并通过特殊的诱导培养基培养，成功地将病人的尿液细胞诱导转变为具有功能的神经干细胞。这些由尿液细胞转变而来的神经干细胞能够在体外扩增并在适当的条件下分化成熟为人体中各种存在的神经元和角质细胞。在进一步的动物模型的移植实验中，能够很好的在46
Nature Methods 10: 84–89 (2013)
1. Isolation and culture ofHuman urine cells(HUCs)取中段尿500ml离心，获得细胞，用尿液细胞培养基（1:1 DMEM/F12 培养基，10% FBS，0.1 mM 非必需氨基酸, 1 mM GlutaMAX，0.1 mM β-疏基乙醇）进行培养。
2. Generation of integration-free
nPcs from human urine cells
a)包含OCT4，SOX2，KLF4 和SV40LT基因的
oriP/EBNA1-based pCEP4 载体与含有miR302–
367 precursor的pCEP4 载体共转染到HUCs。
b)将共转染后的HUCs接种到人工基底膜包被的6孔
板中，用尿液细胞培养基进行培养。
c)第二天换成mTeSR 或5i培养，每两天换一次液，
15天之后，从5i中挑选克隆并于新的人工基底膜包
被的培养皿中进行培养。
d)将细胞分离成单个细胞并用神经细胞的培养液进
行培养。
47
3. Neural differentiation in vitroa)pan-neuronal分化
hUiNPCs 单细胞接种到人工基底膜包被的培养皿中，用神经细胞培养液N2B27并且加入EGF 和bFGF，神经营养因子BDNF，GDNF，CNTF，IGF1（10 ng/m)，1 ?M cAMP，细胞分化两周后，通过检测不同神经细胞的不同标记蛋白来检测分化情况b) 树突细胞的分化
hUiNPCs 种于poly-l-ornithine/laminin基底上，用DMEM/F12 培养基并添加1% N1，biotin (100 ng/ml)，PDGF-AA (20 ng/ml)，NT3 (20 ng/ml), 1 ?M cAMP and bFGF (10 ng/ml) 培养一周。之后三周的培养用IGF1替换bFGF 48
Tumor cell
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肿瘤细胞的培养
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细胞培养皿07-30
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2-(2-氯乙氧基)乙酸的合成11-03
声电联合技术氧化降解2-氯酚的研究10-02
软骨细胞培养及其调控01-20