微生物实验工作总结
一、培养基
（一）培养基的营养成分
一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有些微生物需要添加特殊营养物质（如培养乳酸杆菌时需添加生长因子：维生素）
高考警示钟：自养微生物与异养微生物所需的营养物质不同
(1)自养微生物所需的碳源来自含碳的无机物（如CO2），而异养微生物需要的碳源来自含碳的有机物，因此可根据培养基中营养物质判断微生物的代谢类型。
(2)含氮无机物不但能给自养微生物提供氮源，也能作为能源物质，提供能量，如NH3既作为硝化细菌的氮源也作为能源。
（二）培养基的配制原则
(1)目的明确。要根据微生物的种类、培养目的等选择原料、配制培养基。
(2)营养要协调。各种营养物质要保证适当的浓度和比例。营养物质比例过低，不能满足微生物生长；浓度过高则会抑制微生物的正常生长。
(3)pH要适当。不同微生物生长所需pH不同。如细菌为中性或微碱性（6.5～7.5）；霉菌等真菌为酸性（5.0～6.0）。
（三）培养基的分类及作用：
1.物理性质：根据是否添加琼脂等凝固剂
（1）液体培养基：不加凝固剂，常用于工业生产
（2）固体培养基：加凝固剂，常用于微生物分离、鉴定、活菌计数
2.用途或功能
（1）选择培养基：培养基中加入或去除某种化学物质，允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长。
常见例子：
①培养基中加入青霉素，筛选酵母茵或霉菌等真菌；
②培养基中加入高浓度食盐，筛选金黄色葡萄球菌；
③无氮培养基，筛选固氮微生物；
④无碳培养基，筛选自养微生物；
⑤以石油为唯一碳源，选择能分解石油的微生物；
⑥以尿素为唯一氮源，筛选尿素分解菌；
⑦以纤维素为唯一碳源，通过是否产生透明圈筛选纤维素分解菌。
⑧将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。
（2）鉴别培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品,以鉴别不种类的微生物。
①伊红一美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，茵落呈深紫色，并带有金属光泽)；
②培养基中加入酚红指示剂，鉴定尿素分解菌；
③培养基中加入刚果红（CR），鉴定纤维素分解菌。
注意：
①病毒为非细胞结构的生物体，专营活细胞寄生，目前不能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。
②加入培养基中的凝固剂(如琼脂)，一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。
二、无菌技术
（一）关键
获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌入侵。
（二）消毒、灭菌:
二者主要区别中：芽孢和孢子是否存活（芽孢是微生物度过不良环境的体眠体，而孢子是微生物进行无性生殖时的繁殖体即无性生殖细胞。）
1.消毒:使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分对人体等有害的微生物(不包括孢子和芽孢)
常用方法
应用范围
巴氏消毒法：70～75℃水中煮30min或在80℃水中煮15min
一些不耐高温的物体如牛奶
煮沸消毒法：在100℃水浴中煮沸5～6 min
一般物品
化学药剂消毒法：用乙醇、氯气、KMnO4等药剂来杀死或抑制细菌生长或繁殖
可用来对环境、双手和衣物等消毒
紫外线消毒法：30W紫外灯照射30min
接种室、接种箱、超净工作台
2.灭菌:使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
常用方法
应用范围
灼烧灭菌法：酒精灯火焰
接种工具如接种环、接种针等
干热灭菌法：在160～170℃加热1～2h
如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具
高压蒸汽灭菌：压力为100 kPa，温度为12l℃的条件下，维持15～30 min
培养基及容器的灭菌
注意：
（1）酒精消毒用体积分数为70%的酒精效果最好，浓度过低。杀菌力弱，浓度过高，会使菌体表面蛋白凝固成一层保护膜，乙醇分子不能进入其中
（2）关于高压蒸汽灭菌注意以下几点：
①压力为100 kPa，温度为12l℃的条件下，维持15～30 min；
②注意同时旋紧相对的两个螺旋，使螺栓松紧一致；
③到灭菌时间后，当压力表的压力降为零时，才能打开排气阀，否则灭菌锅的液体会冲出容器，造成污染。
（3）灭菌消毒的原理，就是通过一定理化手段，使病原茵蛋白质变性，失去生命活性。
（4）灼烧灭菌用的是酒精灯火焰的充分燃烧层。
三、微生物的纯化培养技术
（一）常用细菌培养基——牛肉膏蛋白胨培养基配制流程：
计算
称量
溶化
灭菌
注意：据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量
注意：
①倒平板时，烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。
②平板冷凝后要将平板倒置，既可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基造成污染；又可使培养基表面的水分更好的挥发。
（调PH）
倒平板
注意：
①牛肉膏较粘稠，应玻棒挑取，在称量纸上称量
②牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速
注意：
①溶化琼脂时要不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂；
②加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度
注意：
由于不同微生物适宜的pH不同，因此在熔化后，必须用NaOH或HCl来调节pH
注意：
①用高压蒸汽灭菌法
②培养基先调PH再灭菌
③一般是培养基先灭菌再倒平板
计算
称量
溶化
灭菌
注意：据配方计算配制一定体积培养基时各成分的用量
注意：
①倒平板时，烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。
②平板冷凝后要将平板倒置，既可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基造成污染；又可使培养基表面的水分更好的'挥发。
（调PH）
倒平板
注意：
①牛肉膏较粘稠，应玻棒挑取，在称量纸上称量
②牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速
注意：
①溶化琼脂时要不断搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂；
②加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度
注意：
由于不同微生物适宜的pH不同，因此在熔化后，必须用NaOH或HCl来调节pH
注意：
①用高压蒸汽灭菌法
②培养基先调PH再灭菌
③一般是培养基先灭菌再倒平板
（二）纯化大肠杆菌
1．原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是纯化的细菌菌落。
2．微生物接种方法：
平板划线法（只可纯化）和稀释涂布平板法（既可纯化又可计数）
(1)平板划线法：固体培养上→连续划线→逐步稀释→单个细胞繁殖而成的菌落 (如图)
注意：
a.用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；
烧灼时期
目的
取菌种前
杀死接种环上原有微生物
每次划线前
杀死上次划线后接种环上残留菌种，使下次划线的菌种直接来自于上次划线末端，使每次划线菌种数目减少，达到分离菌株的目的
接种结束后
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
b.划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；
c.操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。
(2)稀释涂布平板法：10倍系列稀释操作(一系列梯度稀释) →稀释度足够高的菌液→分散成单个细胞→单个菌落
稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”，应特别注意：
a.配制系列梯度稀释液时，必须用无菌水配制；
b.涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，一面引燃其中的酒精；
c. 吸管头不要接触任何其他物体；吸管要在酒精灯火焰周围使用。
3．菌种的保存
保存时间
保存方法
具体方法
后续处理
频繁
使用
临时保藏法
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养，长成菌落后，放入4_℃的冰箱中保藏
每3～6个月需重新接种。否则菌种容易被污染或产生变异
长期
保存
甘油
管藏法
在3 mL甘油瓶中，装入1 mL甘油后灭菌，将1 mL菌液转移到甘油瓶中与甘油充分混合
放入－20_℃的冷冻箱中保存
将菌种放在低温环境中保藏的目的是降低微生物的新陈代谢速率。
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