dna粗提取与鉴定

时间：2023-06-27 16:56:17 秀雯鉴定材料我要投稿

dna粗提取与鉴定

　　大家知道dma吗？下面我们来做一个实验，了解实验原理，学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。下面小编为您带来dna粗提取与鉴定！

　　dna粗提取与鉴定

　　实验原理

　　DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氧化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大，浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。

　　DNA不溶于95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。

　　DNA中含有脱氧核糖，能与二苯胺(沸水浴)反应生成蓝色物质，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

　　目的要求

　　1.学会DNA的粗提取和鉴定的方法。

　　2.观察提取出来的DNA物质的颜色和形状。

　　材料用具

　　材料：活鸡或鲜血鸡血。

　　仪器：离心机、恒温水裕锅、载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量简(100mL，l个)，烧杯(100mL，l个，50mL、500mL各2个)，试管(20mL，2个)，漏斗，试管夹，纱布。

　　试剂：酒精的体积分数为95%的溶液(实验前置于冰箱内冷却24h)，蒸馏水，柠檬酸钠的质量浓度为0.1g/mL的溶液，氯化钠的物质的量浓度分别为2mol/L和0.015mol/L的溶液，二苯胺试剂。

　　方法步骤

　　实验前需要制备鸡血细胞液(由教师完成)，制备的方法是：取柠檬酸钠的质量浓度为0.1g/mL的溶液(抗凝剂)100mL，置于500mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血(约180mL)注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒入离心管内，用1000r/min的离心机离。2min，此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时，用吸管除去离。心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。

　　1.提取鸡血细胞的细胞核物质

　　将制备好的鸡血细胞液5mL～10mL，注入到50mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒充分搅拌5min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。

　　2.溶解细胞核内的DNA

　　将氯化钠的物质的量浓度为2mol的溶液40mL加入到滤液中，并摇动烧杯，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。

　　3.析出含DNA的粘稠物

　　沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水(这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14mol/L)。

　　4.滤取含DNA的粘稠物

　　用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱布上。

　　5.将DNA的粘稠物再溶解

　　取1个50mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2mol/L的溶液20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中。

　　6.过滤含有DNA的氯化钠溶液

　　取1个100mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。

　　7.提取含杂质较少的DNA

　　在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为95%的溶液50mL(使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳)，并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。注意观察丝状物是什么颜色的。

　　8.DNA的鉴定

　　取两支20mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0.015mol/L的溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。将观察的结果填写在《实验报告册》上。

　　结论

　　步骤8的2支试管中溶液颜色的变化说明了什么？将得出的结论填写在《实验报告册》上。

　　讨论

　　1.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液？

　　2.步骤回和步骤3中都需要加入蒸馏水，两次加入的作用相同吗？为什么？

　　3.DNA的直径约为20×10-10m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？

　　dna粗提取与鉴定

　　【复习目标】

　　本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。

　　【复习重点与难点】

　　复习重点：DNA的粗提取和鉴定方法。

　　复习难点：DNA的粗提取和鉴定方法。

　　【知识回顾】

　　一、实验原理

　　提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。

　　1．DNA的溶解性

　　DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。

　　此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。

　　2．DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性

　　蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80oC的高温，而DNA在80oC以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。

　　3．DNA的鉴定

　　在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

　　二、实验设计

　　1．实验材料的选取

　　凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。

　　2．破碎细胞，获取含DNA的滤液

　　动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。

　　注意：

　　①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

　　蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

　　②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？

　　洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

　　③如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？

　　研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

　　④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？

　　可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。

　　2．去除滤液中的杂质

　　方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

　　注意：

　　①为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

　　用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

　　②方案二与方案三的原理有什么不同？

　　方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

　　3．DNA的析出与鉴定

　　将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。

　　取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

　　三、实验步骤—以洋葱为实验材料

　　1．称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。

　　洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。

　　2．研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。

　　3．向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。

　　此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌（不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物；搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出）。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。

　　4．鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。

　　四、注意事项

　　1．以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。

　　2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

　　3．二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。

　　4．DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：

　　当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。

　　5．盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。

　　鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。

　　dna粗提取与鉴定

　　目的要求

　　1.了解实验原理。

　　2.学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。

　　3.通过本实验培养实验操作能力和观察能力。

　　实验原理

　　1.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。

　　当NaCl的物质的量浓度为0.14mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。

　　2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA.

　　3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。

　　注意事项

　　1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。

　　2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。

　　实验用具

　　鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol／L和0.015mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100mL，1个，50mL，500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。

　　课前准备

　　制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。（也可以用离心机离心2min（转速1000转/分）。用吸管吸去上清液。

　　板书：（课前写好）

　　实验十一DNA的粗提取与鉴定

　　实验原理：

　　1.析出溶解在NaC1溶液中的DNA.

　　2.用冷酒精提取出含杂质较少的DNA.

　　3.DNA在沸水浴时被二苯胺染成蓝色。

　　方法步骤：

　　1.提取细胞核物质：顺时针方向搅拌，稍快，稍重。5min

　　2.溶解DNA：

　　3.析出含DNA的黏稠物：蒸馏水300mL，逆时针方向搅拌，缓慢