斑替枝孢生物学特性及致病性初步的研究论文
加州鲈鱼(Micropterus salmonides)原名大口黑鲈,分类学上属鲈形目(Perciformes),太阳鱼科[1],身体长而侧扁,稍纺锤形,横截面为椭圆形。全身覆盖银白色或淡黄色细密鳞片,但脊柱颜色较深,通常呈绿青色或淡黑色,同时沿侧线附近常有黑色斑纹。腹部呈灰白色。背肉稍厚,墨绿色,体侧青绿。生活在淡水湖泊,原产自美洲,1983年引进中国进行养殖,通过人工驯化后,性格较温和,不喜欢跳跃,容易受到惊吓。加州鲈鱼通常可以在1%以下的咸淡水域中正常生长,水质要求每升水溶氧量在1.5 mg以上,比鲈鱼、鳜鱼耐低氧能力强[2]。鲈鱼肉是高蛋白食物,维生素A和维生素B丰富,滋补肝肾,健脾和胃,而且对感冒止咳有很好的功效,能化痰止咳,含有丰富的微量元素钙、镁、锌、硒等。加州鲈鱼生长迅速,肉质鲜美,容易养殖,且经济效益高,是中国常见的淡水养殖品种。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科,是中国重要的淡水养殖鱼类,它和鲢、鳙、青鱼一起,构成了中国著名的“四大家鱼”[3]。
本研究所用菌株是从患病加州鲈鱼体表分离,通过分子鉴定和形态鉴定,初步鉴定为斑替枝孢(Cladosporium bantianum),属真菌门(Fung)半知菌亚门(Deuter omycota)丝孢纲(Hyphomycetes)丛梗孢目(Miniliales)暗色孢科(Dematiaceae)枝孢属(Cladosporium)。能引起皮肤暗色丝孢霉病[4],尤其侵染脑部引起脑囊肿或脓肿,少数为脑膜炎[5]。在PDA和PCA培养基上生长迅速,菌落扁平。鼠灰色绒毛状,中央高凸,呈纽扣状,表面有不规则皱褶,37 ℃生长良好。在Sabourand培养基上,菌落稍大,灰棕色绒毛状,背面黑色。菌丝灰棕色,分生孢子椭圆形、梨形、链生[6]。
为研究斑替枝孢的生物学特性和对其他淡水鱼类的致病性,本试验通过不同pH和不同温度条件对该真菌的生长状况和菌落大小的影响,研究该真菌的生物学特性。同时将该真菌回复感染草鱼和鲤鱼,观察真菌对草鱼和鲤鱼是否具有致病性,为淡水鱼类的中草药防治提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
该菌株分离自患病加州鲈鱼体表溃烂处,在PDA培养基上纯培养,将获得的纯培养菌株保存于5 ℃冰箱备用。菌株的分离与鉴定见魏福伦等[6]的报道。
1.2 方法
1.2.1 不同pH对斑替枝孢的影响 将该真菌接种在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PDA培养基上,在25 ℃下恒温培养,观察真菌菌株的生长状况,每隔24 h观察一次,采用十字交叉法测定真菌菌落直径并记录下来。每个梯度做3个平板,试验周期为15 d。
1.2.2 不同温度对斑替枝孢的影响 将该真菌接种在PDA培养基上,在温度为5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下培养,观察真菌菌株的生长状况,测量其直径记录下来。每个梯度做3个平板,测量方法同上。试验周期为14 d。
1.2.3 斑替枝孢的致病性 用于回复感染的淡水鱼是草鱼和鲤鱼,取自乌江网箱[7]。取回后置自然条件下培养,待鱼在自然环境中生长状况稳定后进行回复感染。每组10尾鱼装到养鱼箱中,每次试验3箱鱼,一箱为对照组,另两箱为试验组。对照组将真菌菌株接种在鱼胸鳍下,放进鱼箱中培养。试验组一箱鱼直接刮入真菌菌株进行培养,另一箱鱼在鱼胸鳍下接种真菌菌株。每24 h观察一次,观察该菌对淡水鱼是否具有致病性。记录每天的`观察结果,试验周期为20 d。
1.2.4 数据分析 用SPSS_Statistics-v19.0win32软件进行差异性计算,用SPSS软件的单样本t检验计算t值及Sig.(双侧)值。将Sig.(双侧)值与p值进行比较,p值表示概率,得出差异性是否显着。
2 结果与分析
2.1 不同pH对斑替枝孢的影响
由表1、图1可知,斑替枝孢在pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的条件下均能生长。由表1可知,t值各不相同,但Sig.(双侧)值均为0.000,小于显着水平0.05,与t检验的零假设相符,即不同pH之间菌落生长速率存在显着差异(接种菌饼均为2 mm)。pH 9.0时,真菌生长速度最快,菌落直径达52.3 mm,菌落最为致密,pH 7.0、8.0时,真菌生长速度也相对较快,菌落直径分别达51.3、52.0 mm,因此最适生长的pH为9.0。
2.2 不同温度对斑替枝孢的影响
真菌的生长状况在不同温度下有明显的差异,在温度低于5 ℃和高于35 ℃时,均不能生长(接种菌直径为2 mm)。在10~30 ℃范围内,该菌的生长速度随温度的升高而增快,在20 ℃时生长速度相对较快,菌落直径达61.7 mm,菌落最为致密。25 ℃时,真菌生长速度也相对较快,菌落大小为58.7 mm,但菌落不如20 ℃时致密。因此20 ℃为斑替枝孢的最适生长温度。用SPSS软件计算t值和Sig.(双侧)值,t值各不相同,Sig.(双侧)值均小于显着水平0.05,与t检验的零假设不相符,存在显着性差异(表2、图2)。
2.3 斑替枝孢的致病性
将真菌菌株接种于草鱼和鲤鱼,培养后观察,发现此菌株对草鱼和鲤鱼的生长没有明显的影响,没有引起淡水鱼患病或死亡。在鱼体的伤口周围取材进行再培养,没有发现埃里格孢,初步判断斑替枝孢不感染草鱼和鲤鱼,单一菌株的斑替枝孢可能对淡水鱼无致病性。
3 小结与讨论
斑替枝孢是枝孢属真菌,属半知菌亚门,菌丝体淡褐色至褐色,有时产生子座。斑替枝孢又叫毛样枝孢霉、枝孢样枝孢霉,为腐生真菌,广泛存在于自然界的土壤、某些动物的粪便、蔬菜、腐木、鸟巢、腐烂水果中[8],而从鱼类体表溃烂伤口分离该菌株则属首次。
为了对斑替枝孢引起的病害进行有效防治,对从患病加州鲈鱼体上分离的该菌进行生物学特性的研究。研究结果表明,该菌株在PDA培养基上pH为5.0~11.0时均能生长,以pH 9.0时生长最快,菌落最为致密,直径达52.3 mm,为该真菌最适生长pH。该真菌在不同温度下有明显的差异,在温度低于5 ℃和高于35 ℃时,均不能生长。在20 ℃时该菌生长较快,菌落直径达61.7 mm,菌落最为致密,为斑替枝孢的最适生长温度。表明该菌对于温度、pH等条件适应范围广,要求不严格,具有很强的环境适应性。
将该真菌单一接种于草鱼和鲤鱼,并没有表现出对草鱼和鲤鱼的致病性,这有可能是水质问题影响了试验的结果,该菌是否有可能与其他病原菌相互作用、交叉感染而导致淡水鱼类患病,还有待下一步验证。此次试验结果为下一步研究该菌对淡水鱼的致病性提供了一定的参考依据。
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