牙鲆脑中促性腺激素释放激素受体的克隆和鉴定
GnRH(gonadotropin-releasing hormone)是下丘脑-垂体-性腺轴中重要的十肽信息分子,在所有的脊椎动物的生殖神经内分泌调控中具有重要的作用.GnRH成熟的十肽沿着轴突被运送到下丘脑正中隆起(median eminence)末端,然后进入下丘脑垂体门脉循环(hypothalamo hypophyseal portal circulation)(四足动物)或直接通过轴突末梢(大多数硬骨鱼)把信号传递给刺激性腺的细胞,与特异性受体结合,刺激促性腺激素(GtHs,gonadotropins)的合成与释放,参与脊椎动物繁殖的起始和维持正常生殖功能.伴随着GnRH的研究,研究者对鱼类GnRH受体的研究也越来越感兴趣,牙鲆(Paralichthys olivaceus)是中国重要的海水养殖鱼类,本研究从牙鲆脑组织中克隆得到全长的TypeⅠ GnRH受体,并对其组织特异性表达作了分析,为牙鲆的神经生殖内分泌研究奠定了一定的基础.在本研究中,以海水养殖牙鲆为材料,从牙鲆脑组织中采用巢式PCR、5'-和3'-RACE技术克隆得到了1 671 bp牙鲆促性腺激素释放激素受体(GnRH-R)全长cDNA序列,包括147 bp的5'-UTR、1 248 bp的开放阅读框和276 bp的3'-UTR,GenBank登录号是DQ011872.牙鲆GnRH-R和其他物种GnRH-R的氨基酸序列的多序列比对结果显示,其存在许多保守的特征,牙鲆GnRH-R显示有3个主要的功能区域:1个N端胞外结构域(1～44个氨基酸残基)、1个大的跨膜结构域(45～324个氨基酸残基)和1个C端细胞质区域(325～415个氨基酸残基).空间结构预测显示牙鲆GnRH-R跨膜区域包含7个高度保守的跨膜α螺旋(45-64、76-95、114-135、156-176、207-224、267-286、305-324),这些α螺旋是受体锚定到细胞膜上必需的.氨基酸序列系统进化分析表明,牙鲆GnRH-R与琥珀鱼GnRH-R1具有高度同源性(85%同源性).已知的硬骨鱼GnRH-R基因的系统进化分析表明,存在两种类型的GnRH-R基因:Type Ⅰ GnRH-R和TpyeⅡGnRH-R基因.在牙鲆GnRH-R的氨基酸序列中,具有Type Ⅰ GnRH-R共有的典型基序:CAFVT(TM Ⅲ)和DLEGKVSHSLTH(TM Ⅶ开始的序列处),表明克隆得到的牙鲆GnRH-R属于Type Ⅰ GnRH-R.GnRH-R跨膜α螺旋之间的区域形成了胞内或胞外loops,这些区域参与受体信号转导和肽选择性功能上.牙鲆GnRH-R在TMⅢ的细胞质边界处具有一个保守的DRQSAI(DRⅩⅩⅪ/Ⅴ)基序,这个基序被认为参与G蛋白偶联信号转导和GnRH肽诱导受体的激活;另一个保守的区域是位于TMⅦ内的NPXXY或DPXXY基序同样存在于牙鲆中(DPVIY),这个基序参与到一些GPCRs(包括GnRH-R)的内在化(internalization),同时这个基序特别是基序中的Tyr残基对于受体激活和信号转导起到关键作用.在第三个胞内loop中,鱼类GnRH-R有个保守的Ala残基(在牙鲆中为Ala258),其也在G蛋白偶联和受体内在化方面具有重要作用.在哺乳动物或非哺乳动物GnRH-R中,在第一个和第二个胞外loop之间由2个Cys形成1个保守二硫桥,是受体的正确折叠必需的.和其他的GnRH-R一样,牙鲆GnRH-R在第一个和第二个胞外loop之间存在由2个Cys(Cys112和Cys190)可以形成的潜在的二硫桥.这个二硫桥的完全缺失将会影响受体的结构完整性和降低鱼类GnRH-R对GnRH肽的选择性.GnRH-Rs的NH2-末端区域不是很保守,但含有糖基化位点,是GnRH-Rs表达、GnRH-Rs穿梭到细胞胞表面或受体稳定必需的.将mouse的GnRH-R糖基化位点引进到人GnRH-R中,可以增加受体的数量,但不影响受体结合力或肽选择性[25-26].牙鲆Type Ⅰ GnRH-R中在NH2-末端含有3个潜在的糖基化位点(N11SSW、N15GSS和N22WTA),此外,在第一个胞外loop和第二个胞外loop中分别存在1个糖基化位点(N100ITV和N178VTI),牙鲆Type Ⅰ GnRH-R含有的糖基化位点比哺乳动物要多,牙鲆糖基化位点的数目是否/怎样影响牙鲆GnRH-R的表达、降解率或亲和力,应该进一步研究.在牙鲆GnRH-R的第一个胞内loop中,存在1个和tGnRH-RⅢ基序(80KRKSH84)一致的基序(69KRKSH74),这个基序是Gs识别基序(BBXXB,B代表碱性氨基酸,X代表任何一种氨基酸).已经证明这个基序和cAMP产生相关,cGnRH-Ⅱ能通过cAMP-PKA途径提高stbGnRH-R在COS7细胞中的活性.和其他非哺乳动物GnRH-Rs相似,牙鲆GnRH-R含有1个C-末端细胞内尾巴.这种胞内尾巴是鱼类GnRH-Rs功能必需的,在第三个胞内loop中,牙鲆GnRH-R含有2个PKC磷酸化位点(233SKR235和262TLK264);在C端尾巴中,存在1个PKC磷酸化位点(402TAR404).牙鲆GnRH-RC-末端尾巴中含有鱼类GnRH-R具有的Src同源区3(SH3)结合区域(PxxP序列)(340PPAP),能够潜在地传送偶联的能力到丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),GnRH通过PKC和PKA调控GtHα和LHβ转录,二者都集中于MAPK水平.RT-PCR分析表明,GnRH-R在牙鲆脑和垂体有表达,暗示牙鲆GnRH-R参与到生殖行为如产卵行为;RT-PCR也检测到牙鲆GnRH-R在卵巢和睾丸中有表达,其能与牙鲆cGnRH-Ⅱ和sbGnRH在卵巢中共表达,GnRH肽在卵巢中具有自分泌/旁分泌功能,对牙鲆卵巢中的GnRH受体可能起到调控作用.
作 者： 房保海 郑法新 孙修勤 曲凌云 张进兴 FANG Bao-hai ZHENG Fa-xin SUN Xiu-qin QU Ling-yun ZHANG Jin-xing 作者单位： 房保海,FANG Bao-hai(中国海洋大学,生命科学与技术学院,山东,青岛,266003;国家海洋局第一海洋研究所,山东,青岛,266061)郑法新,ZHENG Fa-xin(中国海洋大学,生命科学与技术学院,山东,青岛,266003)
孙修勤,曲凌云,张进兴,SUN Xiu-qin,QU Ling-yun,ZHANG Jin-xing(国家海洋局第一海洋研究所,山东,青岛,266061)
刊 名： 中国水产科学 ISTIC PKU 英文刊名： JOURNAL OF FISHERY SCIENCES OF CHINA 年，卷(期)： 2006 13(4) 分类号： Q959.486 关键词： 牙鲆 促性腺激素释放激素 促性腺激素释放激素受体 Paralichthys olivaceus GnRH GnRH receptor