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BAC-FISH技术在植物基因组研究中的应用
论文导读:：本文将主要讨论BAC-FISH技术的原理。比较作图研究。功能基因定位。
关键词：BAC-FISH，染色体核型分析，比较作图，基因定位
原位杂交技术是一项利用标记的DNA或者RNA探针直接在染色体、细胞或组织水平定位特定靶核酸序列的分子细胞遗传学技术。它的产生标志着传统的细胞遗传学技术向现代分子遗传学技术的转变。原位杂交技术自从产生以来，得到了长足的发展。从放射性标记到荧光标记；从单探针到多探针；染色体的制备也从传统的中期染色体、粗线期染色体，再到DNA纤维，原位杂交技术在其检测的精确度和灵敏度上得到了极大地提高。但是，由于受到信号检测能力的限制，传统原位杂交技术中运用最多的还是5S和45S rDNA、端粒以及着丝粒等区域的串联重复序列，单拷贝或低拷贝小片段在原位杂交中很难检测到。
细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC-FISH) 是以细菌人工染色体(BAC) 克隆作为探针进行的染色体原位杂交，由于克隆的外源片段一般为100 kb以上，其探针与靶DNA序列相遇的机会大，杂交信号检出率大大提高。因此，它较单拷贝或低拷贝小片段DNA序列杂交更为容易，而且准确可靠，从根本上克服了过去单拷贝DNA杂交的困难，大大促进植物尤其是二倍体物种基因组的研究，现已成为植物核型分析、基因定位及物理图谱构建等分子细胞遗传学研究的有力工具。本文将主要讨论BAC-FISH技术的原理，在植物基因研究中取得的重要成果以及新的发展方向。
1 BAC-FISH技术的原理和优势
BAC-FISH中应用的BAC探针主要有两种。第一种是含有染色体特异的散布式重复序列的BAC片段。以一个或多个这样的BAC片段作为探针，其信号能够覆盖整条染色体，所以该方法又称之为染色体涂染（chromosome painting）[1]。染色体涂染技术最早来自于哺乳动物细胞遗传学研究，由Pinkel 等人建立，并用于检测人类21号染色体的三体细胞[2]。目前在哺乳动物、鸟类及爬行动物染色体的研究中应用十分广泛。染色体特异的散布式重复序列是哺乳动物基因组的一大特点，通过流式细胞仪或显微切割技术获得含有染色体专一性重复序列的BAC片段，以这些BAC作为探针能够在细胞核中鉴定出不同的染色体。探针中含有的少量共有序列，可以在杂交前或杂交时通过加入过量的基因组DNA封阻掉。与动物基因组不同，植物中的散布式重复序列往往分布于整个基因组的不同染色体上[3, 4]。这些序列在杂交过程中很难被封阻，从而使得染色体涂色染技术在植物中很难实现[5, 6]，目前仅在拟南芥及其近缘源物种中得到成功应用[7, 8]。
BAC-FISH中使用的另一种探针是，含有单拷贝序列的染色体特异性BAC。利用分布于同一染色体上的一个或者多个含有单拷贝序列的BAC片段对染色体进行杂交。通过杂交信号在染色体上的分布进行染色体识别，以及结构和变异的研究[9]。尽管这些探针的信号不能覆盖整条染色体，但是包含其中任何一个探针的染色体重组都是能够被检测到的，片段丢失和重复也能够通过信号数量的变化检测到。这种染色体特异的单拷贝BAC片段是BAC-FISH技术在植物中使用的主要探针类型。利用该技术，已经在植物中揭示了许多重要的染色体进化事件，包括首次在植物中检测到的着丝粒重排事件[10]。在使用BAC制备探针的过程中，含有着丝粒等染色体共有重复序列区域的BAC必须去除掉，因为它们会在多个不同的染色体上产生杂交信号。此外，在杂交过程中，该基因组的Cot-1 DNA也往往被用作封阻对基因组DNA进行竞争性杂交。Cot-1 DNA仅仅含有高度和中度重复序列，在杂交过程中可以有效封阻掉探针中的重复序列，从而避免探针中重复序列与染色体产生非特异性杂交。
与其它的原位杂交探针相比，染色体专一性BAC探针具有以下优势。首先，针对每一条染色体的探针都是特异的，这样就极大地提高了鉴定的准确性。其次，该技术对染色体制备的要求不高，可以检测几乎所有分裂周期中的染色体，甚至染色体片段[9]。在染色体较小的情况下，多个杂交信号往往会互相干扰甚至重叠，而BAC-FISH技术对每一条染色体的探针都是专一性的，不依赖与杂交信号在染色体上的分布模式，所以该技术尤其适合用于小染色体植物[9, 11-17]。
2 BAC-FISH在植物染色体研究中的应用
2.1染色体识别及核型研究
染色体的正确识别是进行细胞遗传学研究的基础。基于FISH的染色体识别技术，不依赖于染色体的凝缩程度或者臂比的测量，可以在细胞分裂的所有时期将染色体鉴定出来，从而可以研究整个细胞周期中，染色体的行为以及在细胞核中的空间分布[18, 19]。核型研究中运用最多的是5S和45S rDNA、端粒以及着丝粒等区域的串联重复序列[9, 20-23]。这些重复序列在基因组内往往会有多个杂交位点，根据这些信号位点在不同染色体上的分布模式，我们可以区分开同一细胞核中不同的染色体[24, 25, 26]。利用重复序列探针鉴定染色体存在的一个问题是，杂交信号在同一个物种的不同个体间会存在差异，从而会影响我们从不同个体中识别出相同的染色体。此外，局限于杂交位点以及探针种类的限制，特别是当不同的染色体表现出相近的杂交模式时，这种方法就难以对非同源染色体进行准确的区分[9]。
BAC-FISH技术利用染色体专一性BAC片段作为探针，探针信号在染色体上的分布是唯一的，从而可以避免传统原位杂交技术在染色体识别上的困难。BAC-FISH技术首先在水稻、拟南芥等模式植物中取得了成功，目前已经成功地应用到了许多植物染色体鉴定与核型分析的研究中。在水稻中，单个的BAC序列早在1995年就被成功定位到了相应的染色体上[27]。随后，Cheng等人利用24个染色体臂专一性的BAC克隆，成功地区分出了水稻的12对染色体上，并结合已有的着丝粒探针，建立起了一个标准的水稻染色体核型[28]。这些探针还被成功应用到了同属的其它野生稻物种中，说明染色体专一性BAC片段在近缘物种中具有较强的通用性[17]。除此之外，BAC-FISH技术也被成功地用于其它玉米、高粱、小麦等禾本科植物的染色体的鉴定与核型研究中[15, 29-31] [4, 32]。
拟南芥基因组较小，含有的散布式重复序列相对较少，因此它是目前唯一一种成功应用染色体涂染技术的植物。Lysak等人将139个BAC序列混合作为探针，成功地标记出了4号染色体的全部区域。这些探针在能在减数分裂的所有时期识别出4号染色体或者其分布区域[7]。利用多色荧光原位杂交技术，他们进一步鉴定出了拟南芥的所有5对染色体[8, 33]。
随着越来越多的植物BAC序列文库的构建，大量的BAC片段被定位到同一条染色体上，从而构建出越来越详细的染色体核型[34-36]。减数分裂粗线期染色体通常是有丝分裂中期染色体的10-20倍，适用于高分辨率的BAC-FISH作图，能够清晰地显示染色体的形态、结构以及探针的位置[37, 38]。Iovene等人将30个在遗传图谱上定位的BAC片段成功杂交到了马铃薯粗线期的6号染色体[35]。FISH的结果清晰地显示了着丝粒及近着丝粒的异染色质区的位置。最近，Tang等人通过多色荧光原位杂交技术，将60个在RFLP遗传图谱上定位的BAC片段作为探针，成功地在粗线期鉴定出了马铃薯的全部12对染色体[39]。平均每条染色体分布有5个BAC片段，这些探针主要分布于染色体的常染色质区，与它们在遗传图谱上相对应的位置。通过建立这样一个基因组范围的细胞遗传学图谱，得到了一个详细可靠的马铃薯粗线期染色体核型，并将遗传图谱和物理图谱信息结合到了一起。
棉属多倍体植物，由于大量重复序列的存在使得筛选到合适的BAC片度较为困难。此外，棉花染色体较小而多，细胞质浓厚且容易覆盖在染色体上，因而难以获得易于进行原位杂交的染色体制片。研究人员通过选择棉花分子遗传图谱中高重组区的微卫星位点(simple sequence repeats，SSR) 标记的策略，筛选到不含或含有少量重复序列的细菌人工染色体(BAC) 克隆；同时，在通用FISH 技术程序基础上，通过改进发生根、变性、洗脱条件等步骤, 构建出适合于棉花的BAC-FISH 技术，简化了操作流程的同时，获得稳定的杂交结果及较高的检出率；并通过将一随机获得的BAC 进行染色体的物理定位，进一步引入双探针、双色及重复杂交技术，成功地将BAC-FISH技术引入到棉属植物染色体研究中[40]。通过该技术他们首先筛选到7个可以用于BAC-FISH的探针，并成功地鉴定出了多倍体中相应的染色体[41]。通过进一步筛选，成功地鉴定出了四倍体棉花全部的26对染色体[42]。这些BAC探针可以准确地将每条染色体对应到相应的连锁群。比较这26个BAC片段在染上的位置，发现他们都位于染色体的末端或近末端。由于这些BAC片段与遗传连锁图谱上的标记相对应，所以说明棉属植物的染色体交换主要发生在染色体末端区域。通过将于遗传图谱相对应的BAC片段在染色体上的定位，将有助于我们评估遗传图谱标记对染色体的覆盖程度，从而推动棉属植物的基因组研究。
2.2比较作图研究
在水稻和玉米中的研究发现，基因序列以及排列顺序在近源物种中是相对保守的，所以富含基因区的BAC探针在近源缘物种中具有较好的通用性[17, 43]。将这些BAC片段在近缘物种中进行杂交，比较杂交信号的分布，即比较作图技术，可以广泛应用于近缘物种染色体的共线性分析，以及结构变异，从而为研究染色体的进化提供了便利[1]。Lysak等人利用拟南芥染色体专一性探针，对近缘的多个芸薹属物种染色体进行杂交，通过比较这些探针在不同物种染色体上的分布，揭示了在这些物种进化历史上发生的一系列基因组加倍和染色体结构变异事件[8, 44]。
在茄属植物中，BAC-FISH首先被应用到了马铃薯6号染色体与其它茄属植物染色体的比较中[35, 45]。通过比较30个来自于马铃薯6号染色体的BAC杂交信号在西红柿6号染色体上的分布, 发现这些BAC片段在两个物种的6号染色体上是完全共线性分布的,但是异染色质的分布模式有很大的不同。同时通过比较杂交信号的排列顺序，还发现在6号染色体短臂的常染色质区存在一个倒位片段。该倒位片段是以前基于遗传图谱比较所没有发现的，这说明相对于传统的遗传学图谱，高密度的细胞遗传学图谱具有极强的检测染色体变异的能力。同样，利用BAC-FISH技术，通过比较比较马铃薯和西红柿的5号，也发现了同臂内的倒位[46]。Lou等人进一步将其中的13个BAC片段杂交到了茄属的其他物种中[47]。利用这些标记，他们对包括马铃薯、西红柿、茄子等在内的7个茄属物种的6号染色体结构进行了分析，研究了6号染色体在茄属植物中的进化。结果显示，6号染色体在这些植物间具有相似的形态，近着丝粒的异染色质区在所有物种中都有发现。这13个克隆在Solanum caripense， S. melongea，马铃薯，以及另外两个野生马铃薯物种中是完全共线性分布的，并且定位在了非常相似的位置。但是在S. etuberosum 中发现了一个包含整个近着丝粒异染色质区在内的巨大倒位片段，分布于该区域的4个BAC片段的排列顺序与其余6个物种是完全颠倒的。通过临近区域其它几个BAC的位置，确定了导致该倒位的断裂点，位于两个BAC片段之间，该长度大约为6号染色体的1%。这是首次在茄属植物中发现染色体臂间倒位事件。该研究通过在不同物种中比较BAC-FISH作图的结果，还首次建立了一个茄属植物6号染色体的祖先核型。
由于棉花减数分裂粗线期染色体较难获得，并且大量的染色体进一步增加了高质量粗线期染色体制片的难度[48]。所以以前对棉属植物染色体的研究主要集中在有丝分裂或减数分裂的中期染色体上[41, 42, 49-52]。通过进一步改进染色体制备技术，利用高浓度长时间的果胶酶和热处理来分散细胞，Wang等人在棉花中制备出高质量的粗线期染色体制片，并成功应用到了棉花BAC-FISH的研究中，进一步提高了BAC-FISH在棉属植物染色体研究中的分辨率和灵敏度[53]。利用该技术，它们对棉属多倍体A和D基因组的12号染色体结构进行了研究[54]。32个被SSR标记定位到遗传图谱上BAC片段，通过原位杂交的方法成功定位到了12号染色体上。综合分析这些BAC片段的遗传距离和物理距离发现，大部分标记在A和D基因组的12号染色体上是共线性分布的，但是这两对染色体在基因组组成、结构和大小上有着明显的差别。这种差异在染色体上是不均匀分布的，在末端区域差异较小，差异最大的区域存在于长臂近着丝粒的区域。这种基因组的差异主要源于染色体在不同区域不均衡的扩张和收缩。这些结果对研究棉属多倍体基因组进化起了很好的指导作用，并为以后的全基因组测序奠定了基础。
BAC-FISH在其他植物比较作图中的研究包括，利用来自高粱9号染色体的32个BAC片段分别对高粱和玉米染色体进行杂交，结果发现几乎所有的标记在两个物种的基因组中都是共线性分布的，但是信号之间的相对位置有些差异，这说明玉米9号染色体的一些区域发生了不均等的扩张[55]。在葫芦科植物染色体比较作图中的研究，首次发现了植物中的着丝粒重排现象[10]。该研究结果显示，葫芦科植物着丝粒的活性与其近着丝粒区域的异染色质紧密相关，着丝粒的激活与休眠都伴随着其附近区域异染色质的大量获得和丢失。比较染色体作图为我们提供了一条研究相关物种中染色体共线性、重排的新方法，该方法不依赖于作图群体，并且能揭示出染色体重排事件的物理特征，如异位、倒位等[35,44-45]。随着越来越多的BAC文库的建立，基于BAC-FISH的比较染色体作图研究将越来越广泛。
2.3功能基因定位
原位杂交技术对探针的长度具有一定的要求。虽然有报道成功检测到1-3kb的单拷贝片段，但是其结果往往很不稳定，甚至难以重复[9, 56-60]。用传统的原位杂交方法，单拷贝的基因片段很难观察到杂交信号。BAC中的插入片段较长，很容易与靶DNA结合，因此可以利用目的基因所在BAC片段，方便地将其定位到染色体上。从1995年，Jiang等人[27]运用BAC-FISH技术首次将Xa-21定位到染色体上以来，一系列的功能基因被成功地定位到了染色体上[42, 46, 61-68]。
在一些没有全基因组序列的物种中，利用BAC-FISH技术定位基因显得尤为重要。例如马铃薯的5号染色体上存在一个遗传上的热点地区，该区域存在一系列对不同病原体具有抗性的基因，通过遗传作图发现这些基因位于两个遗传作图标记间3 cM大小的区域，但是该区域在染色体上的位置及长度始终不清楚。为了精确定位该区域在染色体上的位置，研究人员从马铃薯的BAC库中，选择与该区域相关的5个BAC片段作为探针，对马铃薯和西红柿的5号染色体进行原位杂交。将该区域定位到了5号染色体长臂的中间区域，在两个物种中。同过测量信号间的距离，发现该区域的长度在马铃薯和茄子中分别为0.85和1.2 Mb[46]。利用BAC-FISH的方法，研究人员还将棉花的乙烯反应原件结合因子（ethyleneresponsive element-binding factor）定位到了A基因组的7号染色体上[42]。
将BAC-FISH与其他的细胞遗传学材料结合，例如DNA纤维[56]，机械伸展的染色体[9]，能精确定位相邻的BAC片段在染色体上的排列顺序，从而进一步提高基因定位的精确度[66, 67, 69-74]。例如，Tomita等人利用5个BAC片段作为探针，结合Fiber-FISH技术，将抗烟草花叶病毒基因（tobamovirus resistance gene L3）定位到辣椒的11号染色体大约400kb的区域，同时发现这些BAC间的空白区域大约为30Kb[67]。
3 BAC-FISH技术的发展及展望
DNA测序技术的快速发展，使得植物全基因组测序成为可能。但是几乎所有现行的基因组测序技术都会留下一些未能测通的空白区域，BAC-FISH技术能对这些空白区域的大小及在染色体上的位置准确判断，从而为制定相应的补全策略提供指导[75, 76]。此外，对于一些特殊的基因组区域，FISH技术仍然是确定其序列，并在染色体上精确定位的唯一方法。例如，含有高度重复序列的着丝粒、端粒等区域，这些区域含有大量串联重复序列，很难被测通。以这些含有这些重复序列的BAC片段为探针，结合Fiber-FISH等技术能够帮助我们确定这些重复序列的拷贝和相对位置[9]。
传统的FISH技术只是把DNA序列定位到染色体上，但是许多生物学问题不能由这样的简单的定位信息来解释。将FISH技术与蛋白质免疫杂交相结合所产生的免疫-原位杂交技术，可以将特定的DNA段与其相互作用的蛋白同时定位到染色体上，为我们提供更多的生物学信息[77-82]。这种技术已经被成功用与研究组蛋白修饰与特定的基因组区域的关系[77-79, 81]，以及着丝粒特异性蛋白与特定重复序列间的关系[80, 82, 83]。将免疫-原位杂交技术与染色体伸展技术相结合，还可以进一`步提高了DNA与蛋白相互作用研究的准确度以及精确性[71, 72, 84]。利用该技术，研究人员将小麦和拟南芥的染色体同时标记上组蛋白CENH3的抗体和着丝粒重复序列探针，从而揭示了着丝粒单元的排列顺序，以及它们与相关蛋白的相互关系[72, 84]。
由于原位杂交中信号的强弱与染色体的状态紧密相关，结构松散的染色体区域能够更好地与探针结合，从而产生强的信号；反之，染色体凝缩的区域与探针很难结合，产生的信号就很弱。因此，杂交信号的强弱可以成为判断染色体状态的一项重要指标。这在研究染色体结构与基因表达、调控的关系中特别重要[85, 86]。最近，研究人员将BAC-FISH与三维空间的原位杂交技术相结合，研究了根表皮发育过程中，染色体结构与基因表达以及细胞分化的关系，结果显示在转录因子GL2附近区域染色体的状态与细胞的分化紧密相关[87]。
利用BAC-FISH技术，以特定染色体专一性的BAC片段为探针，还可以研究染色体的行为。研究人员对玉米B染色体在花粉有丝分裂中的行为进行了研究。利用B染色体专一性探针，对B染色体在不同细胞周期中位置和状态进行研究，结果显示在花粉细胞第一次有丝分裂时，B染色体的大多数能正常分离，但是在第二次有丝分裂时，大多数不能正常分离[88-91]。BAC-FISH技术的进一步发展为我们了解染色体的细微机构，以及染色体行为提供了一个强有力的手段。随着越来越多的基因组被测序，对于染色体结构和行为的研究将有助于我们更好地了解这些植物基因组的功能。
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