WB实验组织总蛋白提取方法

时间：2021-11-05 19:40:26 资料我要投稿

WB实验组织总蛋白提取方法

WB组织总蛋白提取步骤

第一步提取组织蛋白上清液

1，准备裂解液

（1）溶PMSF（将PMSF晶体溶到PMSF溶剂中，即配成10ml100mM的PMSF液体）

（2）裂解液的制备

组成：PIRA裂解液+PMSF溶剂+蛋白酶抑制剂

10mlPIRA=100ulPMSF=1片蛋白酶抑制剂

（3）将配好的裂解液放在4℃备用。

2，研磨组织（心尖）

（1）准备研钵，药勺（2把），长镊子，保温箱（里面放入冰块），汤勺，离心管，天平，手套（2幅），液氮，冰盘，振荡器。

（2）将所有接触到组织的工具用液氮预冷。

（3）1人负责将组织组织给研磨者并随时加液氮（此人必须记住每次研磨者所研磨的组织的编号）2人研磨组织（多次快速），同时一人将1.5ml离心管编号预冷去皮。

（4）将研磨好的组织放在去皮处理的对应的离心管中称重。（用大白纸记录好每个样的'重量，便于离心时配平用）。

（5）加裂解液（1mg组织加6ul裂解液）。

（6）震荡混匀后放入冰盘上，等所有的样加完后一齐在摇床上摇1h。

3，离心提取蛋白上清液

（1）提前30min预冷离心机（4℃）。

（2）配平。

（3）离心，按照配平时的组放样（13000r，5min）。

（4）取上清液，储存在-20℃备用。（提前将1.5ml的离心管编号）。

第二步BCA法测蛋白浓度

1，37℃预热水浴箱

2，配蛋白标准液

（1）准备9个1.5ml离心管并编号A,B,C,D,E,F,G,H,I

（2）按照说明书配制标准样。

3，将蛋白上清液稀释十倍

（1）准备0.5ml的离心管并编号。

（2）取上清液6ul，然后加入54ul蒸馏水，震荡混匀。

2，配BCA工作液

RagentA：B=50:1

工作液所需用量计算：

总体积=（n待测样+9标准样）×2×200ul

其中A液xx，B液xx。

3，向酶标板（96孔板）中加入蛋白和工作液

先加25ul蛋白，再加200ul工作液，每个样加两个孔。

1234596孔板视图6789101112

4，加完工作液后摇床摇30min，放入37℃水浴30min。（最好盖上盖）5，预热酶标仪37℃

6，酶标仪使用方法

（1）打开MPM6软件

（2）File-New

（3）文件-Intrument-Setup-Single-波长562nm-OK

（4）File-Readnewplate

（5）ExpertDate：Max

7，根据OD值的平均数用EXCEL计算浓度（记得x10）。

第三步制备上样蛋白

1，计算500ul上样蛋白组成

蛋白上清液+1x样缓（固定5x样缓100ul）+超纯水（可用蒸馏水代替）

（1）计算500ul上样量所需的蛋白体积

V蛋白=2ug/ul×500ul/实际蛋白浓度（ug/ul）（注意：2ug/ul可以根据实际情况调整的）

（2）计算所需超纯水体积

V水=500-100-V蛋白

（3）数据用excel计算并提前打印。

2，准备1.5ml的离心管编号。

3，将提前将5x样缓取出解冻。

4，按照excel表中数据在离心管中加入蛋白上清液，样缓以及超纯水。5，震荡混匀。

6,100℃水浴15min。

7，分装备用。

作者：尹懿

北京体育大学运动人体科学学院2012级本科

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