高效液相色谱―串联质谱法测定兽药制剂中的金刚烷胺
摘要：根据金刚烷胺的化学性质，结合已有提取方法与仪器公司给予的技术参考，采用高效液相色谱-串联质谱法对兽药制剂中金刚烷胺添加量进行检测，建立了兽药制剂中违禁药物金刚烷胺的高效液相色谱-串联质谱检测方法。用5 %氨水甲醇∶异丙醇（4∶1）超声提取试样中违禁添加物金刚烷胺，以0.1 %甲酸/甲醇溶液进行梯度洗脱，采用电离喷雾电离方式（ESI+），通过多反应监测（MRM）定量。该法灵敏度高，线性关系良好，相关系数r达到0.99，回收率在80.2%～99.8%之间，相对标准偏差（RSD）均小于8%。方法快速、简便、精确度高、准确度高，适用于兽药制剂中金刚烷胺违法添加的定性、定量分析。 关键词：兽药制剂；金刚烷胺；违禁药物；高效液相色谱-串联质谱 中图分类号：O657.7+2；S959.79 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）01-0180-03 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.047 金刚烷胺又叫盐酸金刚烷胺，为对称的三环癸烷，于1960年首次合成，是国际医学界公认对流感病毒有抑制作用的抗病毒药物[1]，生产上主要用于鸡、猪流感的预防和早期治疗，禁止用于抗病毒兽药、规模养殖场饲料等。但养殖户存在滥用现象，对其毒副作用了解不足，用药剂量偏高，常造成养殖动物中毒。 为避免影响国家动物疫病强制性免疫政策落实，给重大动物疫病防控工作带来不良后果，农业部于2005年以农医发[2005]33号文发布了《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》，规定除经批准生产、使用的疫苗产品外，禁止将金刚烷胺用于防治高致病性禽流感等一类病原微生物引起的病毒性疫病[2]。 目前国内尚未确定兽药制剂中金刚烷胺残留量测定的法定方法，文献报道有动物源食品[3-9]、药物[10-12]和人体血浆[13]中检测，鲜见兽药制剂中金刚烷胺残留量测定方法的报道。本研究根据金刚烷胺的化学性质，以现有的文献为基础，采用高效液相色谱-串联质谱法对兽药制剂中金刚烷胺添加量进行检测，经分析，该方法检测灵敏度高、专属性强，对保障兽药安全具有重要的意义。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 ACQUITY Ultra Performance LC超高效液相色谱仪（美国，Waters公司），TQD串联四极杆质谱仪（美国，Waters公司），离心机 HC-3518，涡旋混合器TALBOYS Advanced Vortex Mixer，KQ-500DB型超声波发生器。 异丙醇和氨水（中国，天津市科密欧化学试剂有限公司），甲醇（美国，Fisher公司），金刚烷胺标准品（德国Dr.Ehrenstorfer公司），试验用水均为蒸馏水。 1.2 试验方法 1.2.1 样品前处理 准确称取1.00 g试样至50 mL离心管中，加入10.00 mL 5% 氨水甲醇∶异丙醇（4∶1）溶液超声提取20 min，然后8 000 r/min离心5 min；用移液枪准确移取1.0 mL上清液至10 mL试管中，上清液用氮气吹至近干，准确吸取1 mL 1∶9的0.1%甲酸水溶液∶甲醇溶液到该试管中，涡旋复溶，过0.22 μm滤膜至进样瓶，进行仪器分析。 1.2.2 色谱条件 色谱柱C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱温35 ℃；流速0.3 mL/min；进样量10 μL；流动相0.1%甲酸和甲醇，梯度洗脱程序见表1。 1.2.3 质谱条件 电离方式电喷雾电离（ESI+）；扫描方式正离子扫描；离子源温度110 ℃；脱溶剂气温度380 ℃；锥孔气流氮气，流速50 L/h；去溶剂气流氮气，流速第一文库网600 L/h；碰撞气氩气，碰撞气压3.50×10-4 MPa；检测方式多反应监测（MRM）；多反应监测条件见表2。 2 结果与分析 2.1 方法的线性范围 用基质空白将金刚烷胺标准溶液稀释至适当浓度（0.00、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L）进行测定，以峰面积（Y）为因变量，相应的浓度（X）为自变量作图。结果表明，金刚烷胺溶液浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系，相关系数为0.996 2。以信噪比（S/N）≥10计算，方法的.定量限为0.5 mg/kg。 2.2 方法的回收率与精密度 按照SN/T0001标准的规定，禁用物质或未设定容许限的物质，一般选择LOQ、2LOQ、10LOQ作为添加浓度水平进行回收率试验，本方法用不含以上金刚烷胺的空白样品基质进行3个浓度水平（0.5、1.0、5.0 mg/kg）的添加回收试验，每个浓度水平进行6次重复试验，测得各种农药的回收率范围在80.2%～99.8%之间，RSD均小于8%。 2.3 提取溶液的优化 金刚烷胺略溶于水，溶于乙醇、氯仿，不溶于苯和乙醚。研究者在测定复方氨酚烷胺胶囊中盐酸金刚烷胺及对乙酰氨基酚的含量时采用水提取胶囊中的金刚烷胺[14]，也有人选择流动相乙腈∶水（7∶3，m/v，g/mL，下同）来提取片剂中的金刚烷胺[15]；结合文献的提取方法与仪器公司给予的技术参考，并考虑氯仿的毒性较大且与反相液相色谱的兼容性，分别考察了水、乙腈、乙醇、异丙醇、5%氨水甲醇∶异丙醇（4∶1）的提取效果，提取效果见图1，最后选择5%氨水甲醇∶异丙醇（4∶1）作为提取溶剂。 2.4 仪器条件的优化 采用自动进样，在正离子模式下进行条件优化；选择金刚烷胺最佳的分子离子峰以及其锥孔电压，对碎片选择及碰撞能量进行优化；在优化条件下，金刚烷胺的标准溶液色谱见图2。 2.5 兽药制剂中金刚烷胺非法添加情况 按照建立的方法对市面上收集的15批兽药制剂喹氟宁、替米考星溶液、氟苯尼考粉、水溶性氟苯尼考（氟苯尼考粉）、心肝包治（恩诺沙星可溶性粉）、硫酸新霉素（硫酸新霉素可溶性粉）等进行金刚烷胺添加的普查，15份兽药制剂均未检出金刚烷胺添加。 3 结论 根据金刚烷胺的化学性质，结合已有提取方法与仪器公司给予的技术参考，采用高效液相色谱-串联质谱法对兽药制剂中金刚烷胺添加量进行检测，建立了高效液相色谱串联质谱-电喷雾正离子测定兽药制剂中非法添加物金刚烷胺的检测方法。该法快速、简单、有效、回收率高，可很大程度上降低日常检测过程中的检测成本，缩短检测周期，为兽药制剂中非法添加金刚烷胺检测提供了有效的前处理方法和检测手段。 参考文献： [1] 赵德华，贺 凯，马 玲，等.HPLC-ELSD法测定盐酸金刚烷胺片的含量[J].宁夏医学杂志，2011，33（11）：1045-1046. [2] 陆桂萍，曲 斌，耿士伟，等.液相色谱-串联质谱法检测鸡肉中金刚烷胺残留的研究[J].中国家禽，2013，35（13）：32-34. [3] BJORN J. A，BERENDSEN ROBIN S，WEGH MARTIEN L， et al. Quantitative trace analysis of a broad range of antiviral drugs in poultry muscle using column-switch liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem，2012，402：1611-1623. [4] 艾连峰，马育松，陈瑞春，等.在线净化液相色谱串联质谱法测定动物源食品中金刚烷胺的残留[J].分析化学，2013，41（8）：1194-1198. [5] 孙海新，曹立民，林 洪，等.HPLC-MS/MS法检测鸡肉食品中金刚烷胺残留[J].食品工业科技，2013，34（12）：61-64，89. [6] 云 环，崔凤云，严 华，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉中的利巴韦林和金刚烷胺[J].色谱，2013，31（8）：724-728. [7] 邵琳智，姚仰勋，谢敏玲，等.亲水相互作用色谱-串联质谱法同时测定动物组织中金刚烷胺与利巴韦林[J].分析测试学报，2013，32（12）：1448-1452. [8] 陈慧华，韦敏珏，周 炜，等.液相色谱-串联质谱法测定动物组织中金刚烷胺和金刚乙胺的残留量[J].质谱学报，2013，34（4）：226-232. [9] 云 环，张朝晖，罗生亮，等.固相萃取/LC-MS/MS法检测动物源性食品中的金刚烷胺[J].现代仪器，2009，15（6）：42-45. [10] 聂朝霞，李健和，彭词艳，等.高效液相色谱-质谱联用法同时测定盐酸金刚烷胺和马来酸氯苯那敏的血药浓度[J].中国药业，2012，21（8）：20-23. [11] 尚博扬，彭福林，马 玲，等.盐酸金刚烷胺颗粒鉴别与含量测定方法的改进[J].宁夏医学杂志，2011，33（4）：328-330. [12] 徐晓峰，陈 ?B，宋 敏，等.LC-MS/MS法研究氨金黄敏颗粒中对乙酰氨基酚、盐酸金刚烷胺和马来酸氯苯那敏的人体药动学及相对生物利用度[J].中国新药杂志，2008，17（5）：412-417. [13] HANS J. LEIS W W. Determination of memantine in human plasma by GC using negative ion chemical ionization MS detection after derivatization with a new reagent[J]. Microchim Acta，2012，178：309-314. [14] 修 虹，黄榕珍，付梅春，等.HPLC-ELSD法测定复方氨酚烷胺胶囊中盐酸金刚烷胺及对乙酰氨基酚的含量[J].中国药品标准，2006，7（1）：23-25. [15] 裴 璐，张爱兵.高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定盐酸金刚烷胺片中盐酸金刚烷胺含量[J].中国药业，2012，21（24）：59-60.
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