新型重组人内毒素结合肽突变体的构建及原核表达纯化
目的 构建新型人内毒素结合肽(a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues,EBP_(25))及其突变体(mutant of EBP_(25),mEBP_(25))的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达.方法 采用PCR法,扩增EBP_(25)基因,构建pET-30-EBP_(25)融合表达载体并转化E.coli DH5α扩增.重组质粒经酶切和测序鉴定后,应用快速定点突变法将EBP_(25)第2位缬氨酸和第5位谷氨酰胺所对应碱基均替换成赖氨酸所对应的碱基,突变后重组质粒再经测序鉴定后,将二者转化至E.coli BL_(21)(DE_3)PlysS后经IPTG诱导表达,表达产物采用Western印迹进行鉴定后,用His-Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化. 结果 两次测序结果 显示人EBP_(25)和mEBP_(25)重组序列和理论设计序列完全一致后,经IPTG诱导表达获得目的融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳、Western 印迹证实蛋白表达的特异性,并对蛋白进行纯化,获得EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白. 结论 构建、表达纯化了EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白,为进一步研究其中和内毒素/脂多糖活性奠定了基础.
作 者： 许成燕 刘友生 段光杰 朱江 徐小明 XU Chengyan LIU Yousheng DUAN Guangjie ZHU Jiang XU Xiaoming 作者单位： 第三军医大学西南医院病理学研究所,重庆市,400038 刊 名： 医学分子生物学杂志 ISTIC 英文刊名： JOURNAL OF MEDICAL MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)： 2010 7(2) 分类号： Q78 关键词： 内毒素结合肽 定点突变 原核表达 纯化 endotoxin binding peptide site-directed mutation prokaryotic expression,protein purification