重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响
目的 构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响.方法 以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Western blot检测PKR激活情况.结果 酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24 h时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P＜0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用.结论 成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略.
作 者： 曾建明 冯文莉 王小中 赵世巧 白卫君 罗云萍 温健萍 涂植光 黄宗干 ZENG Jian-ming FENG Wen-li WANG Xiao-zhong ZHAO Shi-qiao BAI Wei-jun LUO Yun-ping WEN Jian-ping TU Zhi-guang HUANG Zong-gan 作者单位： 曾建明,冯文莉,王小中,赵世巧,白卫君,罗云萍,ZENG Jian-ming,FENG Wen-li,WANG Xiao-zhong,ZHAO Shi-qiao,BAI Wei-jun,LUO Yun-ping(重庆医科大学临床血液学教研室,临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆,400016)温健萍,WEN Jian-ping(Canadian Blood Services,Hamilton,ON L8S 1H8 Canada)
涂植光,TU Zhi-guang(重庆医科大学临床生物化学教研室,重庆,400016)
黄宗干,HUANG Zong-gan(重庆医科大学临床学院血液科,重庆,400016)
刊 名： 第三军医大学学报 ISTIC PKU 英文刊名： ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE 年，卷(期)： 2006 28(21) 分类号： Q782 R329.28 R733.722 关键词： 慢性粒细胞白血病 PKR 反义RNA 逆转录病毒载体 基因克隆