人IL-6基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化
构建人白细胞介素6(IL-6)的原核表达载体并优化其表达条件,为IL-6的高效表达提供试验依据.以人T细胞cDNA为模板通过PCR方法扩增IL-6基因,将其克隆到原核表达载体pET28a (+)中,酶切及测序鉴定重组体.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用Western blotting及人IL-6检测试剂盒分析鉴定.在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、卡那霉素浓度、培养温度等来优化IL-6表达条件.结果显示,原核表达载体pET28 a(+)-IL-6成功构建,可在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,得到相对分子质量约22 kD的IL-6蛋白,经Western blotting鉴定正确,经人IL-6试剂盒检测显示具有较高的免疫活性.在 IPTG浓度400 μmol/mL,卡那霉素浓度50 μg/mL,40℃培养6 h的条件下,目的蛋白表达量最高,可占总蛋白表达量的40%.成功构建人IL-6原核表达载体且获高效表达,为研究IL-6生物学活性及产品开发提供了试验基础.
