牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染
为获得转基因克隆牛的供体细胞,采用组织块贴附培养的方法分离培养牛胎儿皮肤成纤维细胞,经2～3次传代纯化,绘制生长曲线,分别分析体外传代培养10代以内和20代以上细胞的核型特征.分别采用800、900、1000 V/cm和1、5、10、15和20 ms的参数组合,将线性化的带有新霉素抗性和绿色荧光蛋白双重筛选标记的人胰岛素原乳腺特异表达载体pNEI电穿孔转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,经800μg/mL G418筛选2周,继续以300μg/mL G418扩大培养2～3代,取部分筛选后的细胞进行PCR检测结果表明,体外培养的牛胎儿成纤维细胞生长旺盛,体外传代20次后核型未发生改变;转染后24～48 h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光表达,筛选后各组克隆形成数以900V/cm和5 ms组最多;PCR检测得到了预期条带,说明目的基因已经成功导入.分离得到的牛胎儿耳成纤维细胞有可能作为体细胞核移植的供体,进行转基因克隆研行究.
作 者： 杨东山 杜晨光 高飞 旭日干 YANG Dong-shan DU Chen-guang GAO Fei BOU Shorgan 作者单位： 内蒙古大学,实验动物研究中心,哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室,内蒙古,呼和浩特,010021 刊 名： 动物学研究 ISTIC PKU 英文刊名： ZOOLOGICAL RESEARCH 年，卷(期)： 2006 27(1) 分类号： Q813 Q959.842 关键词： 牛胎儿成纤维细胞 分离培养 电穿孔 转基因